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发现新型抗菌肽的长征 精选

已有 9325 次阅读 2018-9-28 09:22 |个人分类:科技推广|系统分类:科研笔记| 抗菌肽

从2011年底在美国印地安纳大学开始的设想,经过八个研究组17个人近七年的共同努力,终于在我到了澳大利亚五年后变成了杂志上白纸黑字。虽然这是一篇关于发现新型抗菌肽的论文,但对于其他易于产生抗药性的疾病(例如癌症和病毒性感染)也有相当的指导意义,希望我们的文章能够在抗药性疾病药物的快速、有效研发带来积极的影响。

这个新型抗菌肽新在哪里?有许多天然抗菌肽是靠在细菌膜上穿孔来实现杀菌的目的,而我们的抗菌肽则是跟一些常用的抗生素一样是靠抑制细菌关键蛋白(靶标)的功能来杀菌。但这些常用的抗生素是靠结合在靶标蛋白的活性位点上来抑制其功能,而新型抗菌肽则是靠破坏靶标蛋白的结构来彻底消灭其功能。

破坏靶标蛋白的结构而不是直接抑制其活性位点有什么好处?结构是功能的基础,结构是皮,功能是毛,皮之不存,毛将焉附?也就是说一旦结构被破坏了,想恢复功能就不容易了。如果仅仅靠堵住蛋白的活性部位来抑制其功能的话,蛋白的活性部位可以通过自然发生的局部随机突变来使药物失去它的效果,这就是现在超级、多重耐药细菌产生抗药能力的主要手段之一。如果蛋白结构被破坏的话,局部的突变很难再把结构恢复回去,也就是说从理论上讲细菌将更难产生抗药性。

我们这篇文章是通过寻找能破坏细菌关键蛋白结构的小肽来验证细菌对它的低抗药性。我们选择大肠杆菌的关键蛋白甲硫氨酸氨肽酶作为靶标。我们发现大肠杆菌的甲硫氨酸氨肽酶的第三个螺旋肽片段能抑制其酶活性,而且这个小肽是通过破坏甲硫氨酸氨肽酶的结构来关闭其功能的。小肽所带来的结构变化是通过用Thermofluor方法对暴露的疏水基团的面积,圆二色谱对蛋白质二级结构,核磁共振HSQC谱对三级结构的观察所得到的结论,也被小肽-蛋白的相互作用的分子动力学模拟支持。

这个小肽自己不能穿膜进入大肠杆菌,我们于是接了一个穿膜肽来带它进入大肠杆菌。果然接上这个穿膜肽后,它就能抑制大肠杆菌的生长,而把该小肽的氨基酸系列打乱后的小肽(对照肽),即使接上穿膜肽也不能抑制大肠杆菌的生长。同时我们通过对细胞内酶活性的检测,在变性或半天然条件下的免疫印迹分析,及甲硫氨酸氨肽酶超表达细胞的抑制能力的测量都表明我们发现的这一小肽是在细胞内通过破坏甲硫氨酸氨肽酶的结构及活性来抑制细胞的生长。而且这一小肽不仅仅能抑制实验室的菌株,还能杀死医院里常见的菌株,包括尿道感染患者中分离出的多重耐药大肠杆菌菌株(UPEC isolate EC958)。

细菌对我们设计的这一新型抗菌肽有没有抗性?我们进行了30天的连续传代耐药性测定,未观察到大肠杆菌对该抗菌肽的抗性,而对照的抗生素恩诺沙星的最小抑制浓度却在30天内增加了512倍。

根据分子动力学模拟结果和我们发展的DFIRE统计能量函数的计算,我们发现这一小肽与大肠杆菌的甲硫氨酸氨肽酶的结构核心具有最强的相互作用。利用这个特点,我们设计了针对淋病奈瑟氏球菌的甲硫氨酸氨肽酶的抗菌肽,并发现它不仅可以有效抑制淋病奈瑟菌,包括多重耐药的世界卫生组织淋病奈瑟氏球菌参考菌株(WHO K,L,P strains)的生长,还可以有效抑制该菌对人源宫颈上皮细胞的感染。

我们设计的新型抗菌肽的优点是特异性强。虽然大肠杆菌和淋病奈瑟氏球菌都是革兰氏阴性细菌,而且它们的甲硫氨酸氨肽酶高度同源,有57%氨基酸序列是一样的,抑制淋病奈瑟氏球菌的抗菌肽不能抑制大肠杆菌,而抑制大肠杆菌的抗菌肽也不能抑制淋病奈瑟氏球菌。高特异性使得它能在不影响其它益生菌的情况下,精准地杀死对应的致病细菌。高特异性也间接地带来低毒性,的确,细胞毒性试验表明我们小肽对人源细胞的生长没有什么影响。

总之我们发展了一套方法来设计破坏靶标蛋白结构的小肽。鉴于每种细菌都含有数百种必需蛋白质,大大扩展了抗菌药物靶标选择的范围。这个工作对发展抗癌、抗病毒小肽也有启迪作用,我们目前正在进行的抗癌小肽的研究有很好的进展,当然这一切离动物实验还有一段路,因为这些小肽需要进行适当的化学修饰(如环化,搭桥)来增强它们在体内的稳定性,如果有人愿意在这方面进行合作的话,请直接和我联系。

这个工作是我受到一篇文献的启发而开始的,大肠杆菌的甲硫氨酸氨肽酶这个体系是借用我当时在印地安纳大学同事叶教授的,他的实验室用这个体系来开发小分子药。詹博士在印地安纳实验发现小肽能抑制酶活性后,我们一直也没有太重视。到了澳大利亚,才开始想起可以连接穿膜肽来设计抗菌肽。于是让我女儿去试了试,当时全家刚搬过来,她有空。她在詹博士的指导下发现确实能够抑制细菌生长后,我才真正开始规划与我们糖组学研究所内、所外在各个不同实验上的合作,同时与国内德州学院合作进行了分子动力学计算模拟。我们组的贾博士发现大肠杆菌不能产生抗药性是大家的兴奋点。这个工作于去年拿到了澳大利亚卫生医学研究会的资助。文章在美国实验生物学学会会志(FASEB J.)上发表(不是高影响因子期刊,呵呵)。如果有进一步兴趣的,可以直接看看原文的链接该杂志发的新闻稿,给我们提提进一步工作的意见和建议



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