（原载“中国人兽共患病学报”，2008，24（5）：461－464，图表等有删节）

 

作者：明平刚¹，徐葛林¹，严家新（通讯作者）¹，吴 杰¹，任长庆²，董平国²

 

摘要：

目的  采用实验室检测方法确诊一例特殊的疑似狂犬病病例。

方法  利用荧光抗体（FA）试验、双抗体夹心ELISA和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法对一例死亡的疑似狂犬病人的脑组织和此脑组织经乳鼠脑内接种传代后的鼠脑组织分别进行检测和分析。

结果  死亡病人脑组织的直接FA试验和双抗体夹心ELISA检测为阴性，但RT-PCR检测结果为阳性。将该病人脑组织经乳鼠传代后对鼠脑组织用上述三种方法检测的结果均为阳性。对该街毒株的RT-PCR产物中的核蛋白基因序列进行测定，用Mega3.1软件进行分子进化关系分析，证实所分离的街毒株为基因Ⅰ型狂犬病病毒，与以往在该地区所分离的街毒株有较近的遗传关系。

结论  该病例可确诊为狂犬病死亡病例，其主要和决定性的死因为狂犬病，但并发的肺部感染可能加速了死亡的进程。WHO认为FA技术是狂犬病诊断的金标准，但本病例说明，在某些复杂情况下，只有将多种实验室检测方法联合运用才能确诊狂犬病，而且病毒分离和RT-PCR 可能比FA试验更敏感。

关键词：狂犬病病毒；荧光抗体（FA）试验；ELISA；RT-PCR

             

*国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2007AA02Z402）

作者单位：1.武汉生物制品研究所基因工程室 430060；

2.重庆市巫山县疾病预防控制中心

 

世界卫生组织（WHO）狂犬病专家磋商会2004年报告中明确提出：“只有实验室检查才能确诊狂犬病。”因为“仅靠临床表现诊断狂犬病比较困难，也不可靠，除非出现了特异性的临床体征，如怕风和极度恐水等特异性症状。”

狂犬病病例中有约60%为狂躁型，有十分典型的临床症状；对于此类病例，仅根据临床症状和曾被狗或猫抓咬的病史资料，通常能较有把握地诊断为狂犬病。但即使是此类病例，也不排除有与破伤风、多种病毒或细菌性脑炎、癔病等混淆的可能。

而近年来随着狂犬病实验室诊断技术应用范围的扩大，发现可能有高达40%的狂犬病病例的临床症状并不典型，表现为麻痹或Guillain-Barre 氏症状，属于麻痹型或哑型狂犬病，这些病例在缺少实验室检测结果的情况下常被错误地归类为其他疾病。

我们对一例合并有肺部感染的特殊的疑似狂犬病死亡病人的脑组织样本采用多种方法进行了全面的检测和综合分析，最终得到了明确的结论。

结果说明，实验室检测在狂犬病的诊断中确实具有决定性的作用；在某些复杂情况下，仅仅依靠狂犬病诊断的金标准――荧光抗体（FA）试验的结果还不足以下最后结论，只有多种实验室检测方法的联合运用才能确诊狂犬病，而且病毒分离和RT-PCR 可能比FA试验更敏感。

 

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病史资料  2007年5月25日，重庆市巫山县发生一例特殊的疑似狂犬病死亡病例。死者李某，5岁，于2007年5月7日（死亡前18天）被邻居所养家犬咬伤手臂部位，Ⅲ度暴露，后立即被家人送至其所在的乡镇卫生院进行了“挤压出血、冲洗、消毒”等处理，并同时接种狂犬病疫苗，未注射抗血清。

死者于2007年5月22日（被狗咬伤后第15天）发病，发病时已注射疫苗4针，未完成全程疫苗注射。发病时表现有烦躁、抽搐、流涎、合并有肺部感染等临床症状，被其所在的某县级医院临床诊断为狂犬病。2007年5月25日，患者死亡。对其死亡原因当事各方存有争议。为科学地确定死因，巫山县疾病预防控制中心将死者脑组织样品送至我所基因工程室进行狂犬病的实验室检测。

1.2 方法

1.2.1  荧光抗体（FA）和双抗体夹心ELISA。

1.2.2  病毒分离：取死者脑组织海马回部位的样品0.3g，加…研磨成10％悬液，颅内接种1日龄昆明鼠，每只乳鼠注射10μl。

1.2.3  RT-PCR。

1.2.4  DNA序列分析：对所获得的N基因序列利用MEGA3.1软件与已发表的相关毒株一同构建neighbor-joining(NJ)系统进化树。研究中用于比较分析的其他狂犬病毒N基因序列来源于GenBank。

 

2 结  果

2.1 荧光抗体法检测抗原  直接对疑似狂犬病人脑组织进行荧光抗体检测，结果为阴性；对此脑组织进行乳鼠颅内接种传代后，再对传代乳鼠脑组织进行荧光抗体检测，结果为阳性。

对死者脑组织进行荧光抗体检测并未发现脑组织细胞浆中有特异性荧光颗粒，检测结果为阴性。对传代鼠脑组织进行荧光抗体检测，可见含明亮的苹果绿或黄绿色荧光颗粒，呈不同形状和大小。较大、圆形或椭圆形的、在其周边有较强烈的染色者为内基氏体。

2.2双抗体夹心ELISA检测狂犬病毒抗原  直接对疑似狂犬病人脑组织进行双抗体夹心ELISA检测，结果为阴性；对此脑组织进行乳鼠颅内接种传代后，再对传代乳鼠脑组织进行双抗体夹心ELISA检测，结果为阳性。

对死者脑组织样品用双抗体夹心ELISA法检测，结果表明此脑组织狂犬病毒核蛋白阴性（A₄₅₀值仅为0.061）；对传代乳鼠脑组织样品用双抗体夹心ELISA法检测，结果表明此乳鼠脑组织狂犬病毒核蛋白阳性（A₄₅₀值达到了2.091）。

2.3 病毒分离：将死者脑组织样品接种1日龄乳鼠后，所接种的乳鼠于12天后出现拱背、松毛、麻痹等狂犬病发病症状，出现症状至死亡为1-3天。处死发病乳鼠，取其脑组织分离得到狂犬病毒，命名为CQH07。

2.4 RT-PCR后电泳鉴定结果  用狂犬病毒特异性引物对死者脑组织进行RT-PCR以及对传代鼠脑组织进行RT-PCR，两者的产物经电泳鉴定后，在1500 bp处均可见特异性目的条带。

2.5 分子进化树分析  对所分离毒株进行N基因测序后，选取第1-363位核苷酸，采用MEGA3.1软件，将Genebank中已发表的重庆地区分离的街毒株以及相关固定毒株的对应序列一同构建NJ系统进化树。由图中可知本次分离的街毒株CQH07与在该地区分离的其他5株毒株在进化树上遗传关系较近，它们同CTN在一个分支，其他固定毒株在另一个分支。

 

3  讨   论

WHO狂犬病专家磋商会建议，对于狂犬病的III级暴露，即一处或多处皮肤的穿透性（即出血性）咬伤或抓伤，或被可疑的疯动物的唾液污染粘膜，暴露后预防除了包括正确的伤口处理和使用狂犬病疫苗以外，还包括使用抗狂犬病血清（免疫球蛋白）。从本病例的病史资料来看，从狂犬病暴露后的处治方法方面考虑，造成本病例死亡的主要原因是“未注射抗血清”。此外，对病人进行伤口处理时采用的“挤压出血”，也不符合针对狂犬病的伤口处理规范。

目前，与狂犬病相关的实验室检测方法主要有以下四类,其中以前三种方法较常用：

一，抗原检测，包括荧光抗体（FA）法检测抗原和快速狂犬病酶联免疫吸附法（ELISA）检测抗原；

二，核酸检测，即RT-PCR法扩增并鉴定狂犬病毒核酸；

三，病毒分离，包括细胞培养分离病毒和乳鼠接种分离病毒；

四，抗体检测，包括特异性抗体检测和中和抗体检测。　　

荧光抗体（FA）技术是诊断动物和人狂犬病的一种快速而敏感的方法。WHO认为FA技术“是狂犬病诊断的金标准，但其准确度依赖于检查人员的专业经验、荧光标记抗狂犬病病毒抗体的质量以及荧光显微镜的质量”。

酶联免疫吸附试验（ELISA）检测狂犬病病毒核壳体抗原已使用多年，该方法快速且廉价，WHO认为“可用于流行病学调查”。

关于病毒分离，WHO认为，“要确认抗原检测试验的结果和进一步明确毒株的特性，有必要进行病毒分离。”可通过成神经细胞瘤细胞或小鼠颅内接种进行病毒分离。

目前，WHO不推荐使用多聚酶链式反应（PCR）和其他扩增技术来进行狂犬病的常规死后诊断，但认为在有严格质量控制措施和在这些技术方面有专业经验的实验室，可采用这些分子技术进行流行病学调查^[1]。

在本病例中，我们对该死亡病人的脑组织样品首先进行了抗原检测和核酸检测，抗原检测（FA和ELISA）显示为阴性，而核酸检测（RT-PCR）却显示为阳性。在这种情况下，我们进一步采用了第四种方法即乳鼠的颅内病毒分离法。将病人脑组织悬液接种乳鼠后，乳鼠发病。在随后对乳鼠脑组织的检测中，上述抗原和核酸检测的三种方法检测的结果均为阳性。

分析此病例，综合病史资料和全部实验室检测的结果，首先可以确定该病例为狂犬病死亡病例，这可以从以下几个方面来判断：

1，从流行病史上看，有被犬咬伤的经历；2，从发病和死亡时间上看，被咬后15天发病，发病后3天死亡，符合狂犬病发病的临床诊断标准^[1]；3，从实验室检测结果上看，病毒分离和随后的抗原检测以及RT-PCR检测的结果均可以证实为狂犬病毒感染；4，对该病毒分离株的N基因序列与相关街毒株和疫苗株的系统进化树分析表明，新分离的毒株属于基因Ⅰ型狂犬病毒，与早先在同一地区分离的街毒株有较密切的亲缘关系但又不完全相同，这进一步确证有狂犬病病毒存在同时排除了实验室污染的可能。

但是，此病例又有它特殊的地方，从发病到死亡的时间较短（仅为3天），临床症状不是特别典型，同时显示有肺部感染的症状。我们推测可能是患者肺部并发的细菌感染或其他病毒感染加速了此狂犬病病人死亡的进程。由于死者脑组织中狂犬病毒繁殖时间偏短，病毒的拷贝数可能偏低，结果导致用常规抗原检测方法未能检测出抗原，而检测灵敏度更高的RT-PCR方法却可能检测到极微量的狂犬病毒核酸。另一种解释是病人脑组织的各个部分病毒复制的数量可能有差别，特别是在病毒复制的时间较短的情况下，对病毒感染在脑中的数量分布规律尚了解不多，取样的随机误差也可能造成检测结果的差别。所以在检测结果为阴性时，多次取样、重复检测可能进一步降低漏检的发生率。当然，由于与本病例类似的复杂病例在国内还未见报道，可能还需要更多的病例来证明上述诊断原则的合理性。

我们对本病例的综合诊断结论是，该病例可确诊为狂犬病死亡病例，造成患者死亡的决定因素是狂犬病，但并发的肺部感染可能加快了死亡的进程。WHO认为，FA技术是狂犬病诊断的金标准；但本病例说明，对荧光抗体（FA）法阴性的样品也应持慎重态度，病毒基因组的RT-PCR检测法和病毒分离方法可能较FA法和ELISA法更灵敏。在某些复杂情况下，只有多种检测方法的联合运用和综合分析才能得到狂犬病检测的更可靠的结论。

由于狂犬病是一种致死性疾病，一旦发病，100%死亡，所以狂犬病的诊断结果往往关系重大，必须持特别慎重的态度。本实验室根据以往的大量临床检测实验的经验，目前已初步建立了疑似狂犬病脑组织样品实验室检测的常规程序：首先对疑似狂犬病脑组织样品进行FA和ELISA试验（这两项试验通常可在半天内完成），若FA和ELISA试验结果均为阳性，则可以判定为狂犬病，可在当天发出检测报告；若这两种试验的结果有一种或两种均为阴性时，则对疑似狂犬病脑组织继续进行RT-PCR试验和/或病毒分离试验。只有当后两种方法的检测结果也均为阴性时，才作出狂犬病毒阴性的结论。

对疑似狂犬病脑组织样品进行FA和ELISA试验结果均为阳性的病例，我们通常在当天就作出确诊狂犬病的结论并发出检测报告。对于这类样品，因狂犬病病毒分子流行病学科研工作的需要，我们在发出检测报告后，会对全部样品继续进行大量的检测和分析工作，包括病毒分离、RT-PCR、病毒基因序列测定和分析等。全面回顾这些后续检测的结果，迄今未发现有需要更改当初发出的检测报告的情况。

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