①引物长度一般为15-27 bp，最适为18-22 bp（注意此处所指的长度是结合到模板的长度，不包括5'端加修饰后的长度），过长会导致延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。上下游引物长度差不超过4 bp，Tm差不超过2℃。  

②引物序列在模板其他位置应当没有相似性较高的序列，尤其是3'端，否则容易导致错配。引物3'端避免出现3个以上的连续碱基如GGG或CCC。

③引物3'端的末位碱基对Taq酶合成效率有较大影响，末位碱基为A的错配率明显高于其他碱基，应当避免在引物的3'端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

④引物序列的GC含量一般为40-60%。GC含量过低，则AT含量高，与模板结合能力低；GC含量过高，容易产生二级结构，也不利于结合模板。上下游引物的GC含量不能相差太大。  

⑤引物Tm值范围为55-65℃。Tm值与PCR反应的退火温度相关，退火温度高，引物结合到模板的能力就差（但特异性好）；退火温度低，引物结合到模板的能力就强（但特异性差，非特异性产物多）。因此，如果想提高PCR反应的特异性，可以将引物的Tm设计得高一点，这样就可以把PCR的退火温度相应设定得高一点。Tm值的计算有多种方法，长度在25 nt以内的引物可采用公式粗略计算：Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法（the nearest neighbor method）。

⑥∆G是指DNA双链形成所需的自由能，∆G为负且越小则双链越容易结合，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。3’端∆G值＞-5 kcal/mol，否则容易形成双链结构并引发DNA聚合反应。上下游引物之间不能有连续4个碱基的互配。

⑦引物二聚体及发夹结构的∆G＞-3 kcal/mol，可防止产生引物二聚体环带。

⑧对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

⑨引物最好能跨两个内含子，产物大小在100-200 bp。

注：以上仅供参考，黄色部分待商榷，欢迎大家指正！

附引物设计软件及网站：

a. Oligo 7
b. Premier 5
c. NCBI—Primer BLAST

d. PrimerBank

e. RT PRIMER DB

f. Google Scholar

参考百度文库https://wenku.baidu.com/view/5efd1062fd0a79563d1e721d.html?fr=search

、好看视频https://haokan.baidu.com/v?vid=2625940282406102608&pd=bjh&fr=bjhauthor&type=video及天根生化公司技术讲座视频。