生物学上的一个重要挑战是如何了解生命体的巨大结构和功能复杂性。这种复杂性体现在各个尺度层面，包括从蛋白网络结构到细胞内各种细胞器，从组织内多样的细胞类型到功能化器官中协同作用的组织，最后在中枢神经系统达到最高。中枢神经系统中存在多种相互作用的细胞类型；同时，单个神经元可以向多方向延展并且投射很长的距离。因此，开发在三维空间大尺度上对多靶点同时成像的工具将大大提升解析复杂脑神经网络的能力。

免疫荧光成像技术是了解组织中细胞种类和状态的重要手段。标准的免疫荧光成像由于较宽的荧光光谱，通常只能实现不多于5种目标蛋白的同时观测。近年来，多重蛋白成像技术快速发展，但仍局限在较薄的样品中。质谱成像对样品有破坏性且缺乏三维断层成像能力。循环荧光多色成像方法依赖于多轮免疫标记及洗脱，而厚组织的多轮标记、洗脱、重新标记非常耗时且难以避免样品非线性形变带来的轮与轮之间配准误差。因此这些技术仅被用于较薄组织样品尺度（<100微米）上。总结来说，现有的多重蛋白成像技术都较难发展到厚样品中（下图），方便可行的多重、大体积蛋白成像技术仍待开发。

为了解决这个挑战，闵玮团队研究人员建立RADIANT技术(RAman Dye Imaging And Tissue clearing)，利用先进的拉曼显微术，实现单轮多重三维蛋白成像。由于拉曼光谱的峰宽（~10 cm^-1）远窄于荧光（~500 cm^-1），拉曼成像能够突破荧光通道数量限制，在单轮多重成像（单轮染色、单轮成像）方面具有显著优势。这种单轮的优势在大尺度三维成像上尤为显著，能够在根本上规避上述多轮循环荧光方法中的核心技术困难。电子预共振受激拉曼散射显微镜（epr-SRS）是一种闵玮团队开发的新兴的超灵敏振动成像方法【1】：通过结合电子预共振效应和受激拉曼散射显微术，能够实现对拉曼染料的亚微摩尔级别的检测。Epr-SRS显微术作为一种双光子技术，具有光学断层成像能力。然而，受限于生物组织中的光散射效应，epr-SRS成像深度不超过100微米。

为了将epr-SRS通用化至大尺度三维成像，研究人员设计引入组织透明化技术。然而，现有的组织透明化技术几乎都是为荧光显微术开发的。对于拉曼成像而言，一个主要的不同点是作为成像介质的高浓度的折射率匹配溶液（RIMS）可能会带来巨大的拉曼信号，从而使得拉曼染料特征峰湮没在背景之中。通过对常见组织透明化技术中使用的RIMS的拉曼光谱学研究，课题组发现三键振动区（2000-2400 cm^-1）是一段无背景区域。

基于此，研究人员进一步发展了相应的光谱正交的拉曼染料探针MARS，每个MARS探针都有其特征的氰基振动峰（下图a），确保了之后的拉曼探针成像不会受RIMS拉曼信号的影响。通过将MARS染料结合到抗体上，可以实现对特定蛋白的免疫拉曼成像，称为immuno-eprSRS。值得一提的是immuno-eprSRS具有与免疫荧光相接近的信号水平以及亚细胞空间分辨率（下图b-c）；适用于多种组织样品，包括福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE) 人体组织样本。

研究人员基于MARS探针，广泛筛选了适合拉曼染料成像的组织透明化方法。作者发现有机溶剂透明技术uDISCO【2】相比于其他方法能够提供最高的信号水平。在uDISCO的基础上，作者继续优化了有机溶剂的选择、温度、抗氧化添加剂等条件，提出了rDISCO方案，成功实现1毫米深度下的免疫拉曼成像。由于MARS染料结构设计的相似性，rDISCO对其余染料分子具有普编适用性。

最后，作者展示了小鼠毫米级小脑组织上11个靶点的同时成像，打开了令人激动的多重三维蛋白成像领域。相比于循环免疫多色荧光方法，RADINA成功将多色蛋白成像深度延伸了10倍。从该多色三维图像中，研究人员进一步提取了多种系统性信息，包括区域分割、空间相关性、细胞组成、三维距离分析和网络拓扑结构，实现对复杂生物组织的分子水平解析。

综上所述，作者通过对拉曼光谱成像技术、组织透明化方法和染料设计的有机结合，开发了RADIANT技术。该工作展示了拉曼成像方法在高内涵、大尺度蛋白成像方向上的独特优势，为在原位三维空间下系统性解析生物组织的分子信息提供了途径。研究人员预期RADIANT技术可应用于解析神经元回路、建立组织图集、研究肿瘤异质性及其与周围免疫系统的联系等方面。

美国哥伦比亚大学化学系和Kavli脑科学中心的闵玮教授为该论文通讯作者，施立雪博士和魏冕博士为文章的共同第一作者。苗宇鹏博士，钱乃馨和石玲燕博士也对该研究做出了重要的贡献。

闵玮团队欢迎新的研究生和博士后加入其课题组！

相关论文信息：

DOI:  10.1038/s41587-021-01041-z

1. Wei, L. et al. Super-multiplexed Super-multiplex vibrational imaging, Nature 544, 465-470 (2017).

2. Pan, C. et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods 13, 859–867 (2016).