植物发育时期驱动玉米微生物组生态角色的分化

Plant developmental stage drives the differentiation in ecological role of the maize microbiome

Microbiome [IF: 14.65]

DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-021-01118-6

发表日期：2021-08-13

第一作者: Chao Xiong(熊超)(cxiong_eco@163.com)
^1,2

通讯作者：Li-Mei Zhang(张丽梅)(zhanglm@rcees.ac.cn)^1,2

合作作者: Brajesh K. Singh, Ji-Zheng He, Yan-Lai Han, Pei-Pei Li, Li-Hua Wan, Guo-Zhong Meng, Si-Yi Liu, Jun-Tao Wang, Chuan-Fa Wu, An-Hui Ge

主要单位：

¹中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室（State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China）

²中国科学院大学（University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

摘要

植物的各个部位栖居着大量高度多样的微生物，对植物养分吸收、病害抵御和适应环境胁迫等各方面具有重要影响，但目前对于植物生长发育是否以及如何影响作物微生物组的群落构建、生态功能以及微生物互作网络仍然缺乏系统的认识。本研究同时在两个相距较远的地区考察了玉米不同生长发育时期下土壤（根际及非根际土壤）及植物部位（包括根和叶的表面和内部以及玉米籽粒）的细菌和真菌群落演替动态及其跨界互作模式，并以田间放置的塑料植物叶片作为背景对照，评估了大气环境对植物叶际微生物群落的影响，并利用宏基因组学技术进一步研究了叶表微生物组的潜在生态功能。

结果表明，植物不同发育时期对作物微生物组的多样性、群落组成、确定性/随机性群落构建以及网络互作模式具有较强影响，且对叶表微生物组的影响最为强烈。溯源分析表明大气环境（以塑料植物叶片为代表）是叶表微生物群落的重要来源，叶表微生物组同时受到植物生长发育和季节相关的环境因子（如温度和降水）的共同影响。植物部位细菌群落在苗期具有较高的alpha多样性并主要受确定性过程影响，而真菌群落主要在成熟期表现出类似的特征。网络分析和随机森林模型分析进一步表明，作物苗期的细菌群落在微生物共现网络和作物产量预测中更为重要，随着植物生长，真菌的作用越来越重要。宏基因组分析结果表明，苗期的玉米叶表微生物组具有更高的功能多样性和更高丰度的养分供应相关的基因，而后期则富集了更多与氮同化和碳降解相关的基因。此外，属于放线菌门、伯克氏菌科以及根瘤菌科的潜在有益细菌在植物发育早期显著富集，而腐生真菌在植物发育后期显著富集。

以上研究结果表明，植物生长发育时期对其微生物组的组成和功能具有较强的调控作用，细菌和真菌群落分别在不同时期发挥主要生态角色。本研究通过田间试验验证，揭示了植物生长发育过程中宿主植物可以通过确定性选择过程对其微生物组产生较强的调控效应。这些发现可以为未来微生物组调控策略的制定、相关菌剂的开发以及农业可持续生产提供重要参考。

引言

大量高度多样的原核和真核微生物群落生活在植物的各个部位，它们与宿主植物长期共进化并对植物的多方面功能和性状具有重要影响。例如，一些生活在根际和植物部位中的固氮菌、拮抗细菌和菌根真菌等有益的微生物类群，可以通过促进植物养分吸收、增强植物抑病能力及改善植物的环境胁迫抗逆性等途径影响宿主植物的生长发育及健康。近年研究发现植物微生物组群落构建过程以及宿主植物的健康状态主要受宿主、微生物、以及环境间复杂及动态的互作关系影响，但是我们对于驱动植物-微生物组-环境相互作用的基本生态过程仍然了解较少。进一步认识植物微生物组群落构建、生态功能以及互作网络的动态变化及作用机制，对于未来充分发挥和调控微生物组功能、开发农业微生物组资源及促进农业可持续生产具有重要意义。

植物微生物群落在种子播种后即开始形成，并在确定性(如生物和非生物因素介导的选择效应)和随机性(如随机扩散和生态漂变事件)过程的影响下随植物生长发育而发生变化。微生物群落不仅可以通过种子的垂直传播遗传给下一代，还可以从土壤、大气和领近植物中扩散和定植到植物部位，并在多种宿主和环境因素的综合作用下形成一个动态群落。一方面，宿主植物可以通过免疫系统、遗传网络和分泌物对其微生物组产生强烈的选择效应。另一方面，多种环境因素如气候、土壤性质(如pH和土壤养分)和人类干扰（如农业管理制度）也在植物微生物组群落构建过程中发挥重要作用。近年大量研究表明，植物相关的微生物群落主要是由部位生态位和宿主种类决定，植物叶表和根表是宿主与环境相互作用的重要界面。此外，植物发育时期对其微生物组的形成、稳定和动态变化也具有重要影响，这主要是因为植物的生理需求以及代谢产物会随着其生长发育时期的变化而发生改变。同时，植物发育时期对微生物群落的影响还包括空气、灰尘、降雨和温度等季节性环境因素的影响。然而，在不同气候、土壤因子以及施肥调控措施等多种因素的综合作用下，植物发育时期如何影响土壤-植物连续体上微生物群落的组成和功能，目前我们还缺乏系统的实验证据。

除宿主和环境因素外，微生物之间的相互作用对植物微生物组的群落构建过程及植物-微生物组稳定性也有较大影响。例如对拟南芥根系微生物组的研究表明，细菌、真菌和卵菌之间的微生物互作对拟南芥的生存具有重要影响，其中细菌群落在抵御病原菌及维持植物健康方面发挥关键作用。然而，对于植物不同发育时期下土壤-植物连续体上细菌-真菌跨界互作动态以及这些复杂的微生物互作如何影响微生物组群落构建和宿主健康，目前仍然存在较大的研究空白。本研究以在河南许昌(潮土)和云南曲靖(红壤)布置的田间施肥试验为对象，研究了玉米三个不同发育时期下土壤(非根际和根际土壤)、多个植物部位(根表、根内、叶表、叶内和玉米籽粒)以及假植物的塑料叶片(代表当地气候和空气环境)共计432个样品中细菌和真菌的群落动态，以期探明：(1)研究土壤类型、气候和施肥管理措施等环境因子与植物生长发育如何共同交互影响土壤-植物连续体上微生物组的群落构建过程;(2)探究植物不同发育时期细菌和真菌群落的跨界互作网络模式及生态功能。我们的科学假设是：(1)植物发育时期对植物微生物组的影响大于环境因素的影响并对微生物群落产生较强的确定性选择效应，但是对于土壤微生物组相反；其次，叶表微生物群落由于同时受到宿主发育和季节性环境因素的影响从而具有更强的时期动态；(2)微生物跨界互作网络模式和微生物组功能会随着植物生长发育而发生变化，细菌和真菌群落在植物不同发育时期的生态重要性也相应发生变化。

主要结果

植物不同发育时期细菌和真菌的多样性和群落构建过程

线性混合模型分析表明，植物发育时期对植物部位中细菌和真菌群落的Chao1丰富度指数具有较大影响，而对根际和非根际土壤的影响较小。对于植物部位，细菌群落的Chao1丰富度指数从苗期到成熟期呈下降趋势，而真菌群落呈现上升趋势（图1）。

图1 作物微生物组多样性及分布格局的时间动态变化

作物相关微生物组的多样性和分布模式的时间动态；

a 三个不同时期植物(包括叶表、叶内、根表和根内)及土壤(包括根际和非根际土壤)部位细菌和真菌群落的alpha多样性；

b 土壤-植物连续体上细菌和真菌群落基于加权 UniFrac 距离矩阵的NMDS排序（n=432）。箱线图上方的不同字母表示由非参数 Kruskal-Wallis 检验确定的显著差异。通过PERMANOVA 检验了不同因素对群落差异的相对贡献。“N”代表部位生态位的影响，“D”代表发育时期的影响，“S”代表地点的影响，“XC”代表站点“许昌”，“QJ”代表站点“曲靖”；

c  每个部位中细菌和真菌群落基于加权 UniFrac 距离矩阵的NMDS排序(叶表中n=144，其他部位n=54)。

PERMANOVA分析和NMDS排序结果表明，在大部分植物部位生态位(叶表、叶内和根内)，植物发育时期对细菌和真菌群落分异具有最大的解释量(16-45%)，其中植物叶表的时期效应最强(细菌45.1%，真菌39.6%)(图1)。而根表、根际和非根际土壤的微生物群落分异主要由地点解释(31-65%）(图1)。在植物整株水平，微生物群落结构分异主要由部位生态位(细菌54.8%，真菌39.6%)解释，其次是发育时期(细菌6.1%，真菌5.4%)和地点(细菌3.7%，真菌7.5%)(图1)。对于所有样品及单个部位样品，施肥调控措施对微生物群落的影响都较小。虽然玉米叶表微生物群落与假植物塑料叶表群落具有显著差异(P < 0.01)，但是二者表现出类似的时间动态特征(图1)。

零模型分析表明，植物发育时期对作物微生物组群落构建过程具有较大影响，尤其是叶表和叶内生态位(图2)。在苗期，植物部位细菌(约71%的样品被确定性过程主导)群落构建过程中确定性过程的相对贡献高于真菌群落(约47%)。随着植物生长，确定性过程在细菌群落构建中的相对贡献在成熟期降低到53%，但是在真菌群落中增加到64%(图2)。总体而言，确定性过程在早期对作物细菌群落构建的影响较大，在后期对真菌群落的影响较大。而根际(71-81%)、非根际土壤(61-76%)和塑料叶表(87-100%)的微生物群落构建主要受确定性过程主导，并在植物不同发育时期变化较小(图2)。

图2 植物不同发育时期微生物组群落构建过程中的确定性和随机性

微生物组组装中的确定性和随机性过程；

a 基于 β-最临近物种分类指数 (βNTI) 值的土壤-植物连续体上细菌和真菌群落构建过程中确定性过程和随机性过程的相对贡献。βNTI 值使用零模型计算，其中|βNTI| ≥ 2表明确定性过程主导群落构建过程，而|βNTI| < 2则表明随机性过程主导。小提琴图上方和下方的百分比分别代表确定性过程和随机性过程在微生物组群落构建过程中的相对重要性。 “endo” 代表 “内圈”；

b 基于β-最邻近物种分类指数(βNTI)和基于 Bray-Curtis的Raup-Crick指数(RCBray)将确定性和随机性过程分为5个基本生态过程，包括异质选择(βNTI < −2)、同质选择(βNTI > +2)、扩散限制(|βNTI| < 2且RCBray > 0. 95)、同质扩散(|βNTI| < 2且RCBray < −0.95)及非主导过程(|βNTI| < 2且|RCBray| < 0.95)，百分比堆积图展示了这5个生态过程在不同部位不同时期中的相对重要性。

微生物跨界互作网络的时间动态变化

我们进一步通过网络分析评估宿主发育时期对土壤-植物连续体上细菌-真菌跨界互作模式的影响。结果表明，细菌-真菌跨界互作模式在3个发育时期发生了明显的变化，宿主不同发育时期细菌和真菌类群在网络中的生态角色发生转变(图3)。植物苗期细菌类群比真菌类群在网络中具有更高的网络连通性(即网络连接度)，而在成熟期这种趋势则相反(图3)。真菌类群的网络连接度(平均网络连接度)从苗期的2.2增加到成熟期的17.8(图3)。网络中负相关边(主要属于细菌-真菌界间关系)的比例从苗期的6.1%明显增加到成熟期的50.5%(图3)。我们进一步将“网络中心节点”定义为网络中连接度较高(> 50)且紧密中心度也高(> 0.3)的节点，发现在植物苗期有3个网络中心节点(细菌3，真菌0)，抽雄期有2个中心节点(细菌1，真菌1)，成熟期有10个中心节点(细菌4，真菌6)(图3)。

图3 细菌-真菌跨界互作网络的时间动态

细菌-真菌跨界网络的时间动态；

基于所有样品的共现网络分析展示了微生物跨界互作网络在(a)苗期、(b)抽雄期和(c)成熟期间的动态变化；

d 不同发育时期细菌和真菌类群在网络中的节点水平拓扑属性(度和紧密中心性)的比较。不同字母表示通过非参数 Wilcoxon 秩检验确定的显著差异；

e 不同发育时期细菌-真菌类群在跨界网络种的多重相关性(互作关系的变化)。

我们进一步对每一个部位的微生物群落进行网络分析，同样发现植物部位的微生物界间网络模式在三个发育时期发生了明显的变化，尤其是叶表和叶内。而根际和非根际土壤微生物群落的网络模式在三个发育时期相对稳定。对于4个植物部位生态位，我们同样发现从苗期到成熟期网络中细菌节点的数量逐渐减少，而真菌节点的数量及其网络连接度明显增加。

微生物群落组成的时间动态及植物-微生物-环境相互作用

三个不同发育时期植物部位的微生物群落组成具有明显变化，而根际和非根际土壤的变化较小(图4)。线性混合模型分析表明，植物发育时期对细菌中放线菌(F = 132.7，P < 2.2e-16)和拟杆菌(F = 78.4，P < 2.2e-16)及真菌中子囊菌纲(F = 34.0，P = 8.3e-14)和座囊菌纲(F = 20.0，P = 1.6e-8)的影响最大。植物部位的放线菌在苗期(26.1%)比抽雄期(15.9%)和成熟期(12.1%)具有更高的相对丰度。从苗期到成熟期，根表环境中座囊菌纲的相对丰度呈上升趋势，而在根内环境中呈下降趋势(图4)。在两个研究地点，塑料叶表和玉米叶表的真菌群落在不同发育时期中均以座囊菌纲为主(图4)。在ZOTU水平的差异丰度分析进一步表明，细菌伯克氏菌科、微杆菌科、链霉菌科和根瘤菌科中的一些类群在苗期的植物部位中显著富集。而真菌群落中Coniothyriaceae、Mycosphaerellaceae、Sporidiobolaceae和Symmetrosporaceae的一些类群在成熟期的植物部位中显著富集，并且这些科中的一些属是成熟期微生物界间网络的中心节点。

图4 植物不同发育时期细菌和真菌的群落组成及生态重要性

细菌和真菌微生物组的物种分类组成和生态重要性；

a 两个研究地点细菌和真菌群落组成的时间动态。“XC”代表站点“许昌”，“QJ”代表站点“曲靖”。所有样本中总序列 数少于1% 的低丰度门/纲被分视为“Other”；

b 通过随机森林模型分析评估细菌和真菌群落组成对作物产量预测的相对重要性。 P < 0.05，** P* < 0.001。 MSE百分比的增加等于均方误差百分比的增加。

随机森林模型分析表明，苗期细菌的群落组成对作物产量预测更为重要，而在成熟期真菌对作物产量预测具有更重要的角色(图4)。Mantel检验结果表明，植物不同发育时期，根际和非根际土壤中的细菌群落与土壤氮循环相关的酶活(如固氮酶活性和潜在硝化速率)显著相关。而真菌群落与C和P循环相关的土壤酶活(如β-葡萄糖苷酶和磷酸酶)显著相关。溯源分析进一步发现，玉米果实(籽粒)可能从临近的物种库如叶片(细菌：46.5%，真菌：28.4%)和根(细菌：39.6%，真菌：58.1%)中选择大部分的微生物类群。空气(以假植物的塑料叶表代表)是玉米叶表微生物群落的重要潜在来源(细菌：67.7%，真菌：88.8%)，从苗期到成熟期空气微生物群落对玉米叶表微生物群落的来源贡献比例逐渐增加。

作物叶表微生物组的生态功能特征

宏基因组分析结果表明，玉米叶表微生物组的功能组成(基于KO的NMDS排序)与塑料叶表微生物组的功能组成具有显著差异(R2 = 44.3%，P < 0.01)，植物发育时期对玉米叶表(R2 = 50.0%，P < 0.01)和塑料叶表(R2 = 84.1%，P < 0.01)的微生物组功能也有显著影响(图5)。玉米叶表微生物组在苗期具有较高的功能多样性(以KO、CAZyome和COG功能特征为基础计算的Chao1丰富度指数)，而假植物的塑料叶片则表现出相反的模式(图5)。差异丰度分析结果表明，玉米叶表在苗期特异富集了更多的功能属性(包括KO、CAZyome和COG)(图5)。一些与醌氧化还原酶(NAD（P）H)、糖基转移酶(GT31)和抗病(K13457，很可能来自宿主基因组)相关的功能基因/模块在苗期显著富集(图5)。此外，C、N、P循环相关的功能基因在三个发育时期表现出不同的分布模式(图5)。与硝酸盐还原有关的功能基因(narG和narH)在苗期更为丰富，而氧化亚氮还原酶基因(nosZ)、氮同化基因(nasA和nasB)、以及碳(C)降解(xylA和amyA)和磷(P)转运(pstA和pstB)相关功能基因在其他两个发育时期更为丰富(图5)。

图5 植物不同发育时期叶表微生物组的生态功能特征

叶面微生物组的功能概况

a 基于 KEGG Orthology (KO) 的 Bray-Curtis 距离矩阵的非度量多维尺度(NMDS) 排序分析显示玉米叶面微生物组与塑料叶片微生物组显著不同(n = 18)，箱线图显示了塑料叶片和玉米叶面微生物组在三个发育阶段的功能多样性(包括 KO、CAZyome 和 COG)。使用 PERMANOVA 检验了不同因素对微生物组功能组成的相对贡献。箱线图上方的不同字母表示由非参数 Kruskal-Wallis 检验确定的显著差异；

b 三元图描绘了在幼苗期显著富集的玉米叶面微生物组的功能特征(包括 KO、CAZyome 和 COG)(FDR，P < 0.01)。每个圆圈代表一个功能基因/模块(即 KO、CAZyome 和 COG)，每个圆圈的大小代表其相对丰度；

c 热图展示了参与 C、N 和 P 循环的功能基因(基于 KO)的相对丰度(Z 分数)，在三个发育阶段中的变化。

结论

本研究为不同环境条件下作物微生物组结构及功能的时期演替特征提供了系统的描述。结果表明，植物发育时期对植物部位中微生物群落属性(如alpha多样性、群落结构、确定性/随机性群落构建模式和跨界互作网络)的影响显著高于对土壤微生物的影响，其中对叶表微生物的影响最为强烈。大气环境(以塑料植物叶片收集的样品代表)是叶表微生物群落的重要来源(细菌：67.7%，真菌：88.8%)，叶表微生物群落受宿主发育和季节性环境因素的共同影响。

我们进一步揭示了细菌和真菌群落在作物不同发育时期的生态角色不同，细菌在作物发育早期的养分供给及健康维持中更为重要，而在作物生长后期，真菌群落在碳（C）循环过程中发挥着越来越重要的作用。此外，我们发现确定性过程对早期植物部位的细菌群落构建起主导作用，而在后期则是对真菌群落构建起主导作用。这些结果表明在植物生长发育过程中，宿主植物对其微生物组的组成和功能具有强烈的选择性调节作用。这些发现可以进一步加深我们对植物-微生物组互作机制的认识，为未来合成群落研究和微生物组调控技术的开发应用提供了重要信息。

作者：熊超 中科院生态中心

责编：马腾飞 南京农业大学

审核：刘永鑫 中科院遗传发育所

Reference

Chao Xiong,Brajesh K. Singh, Ji-Zheng He, Yan-Lai Han, Pei-Pei Li, Li-Hua Wan, Guo-Zhong Meng, Si-Yi Liu, Jun-Tao Wang, Chuan-Fa Wu, An-Hui Ge, Li-Mei Zhang. Plant developmental stage drives the differentiation in ecological role of the maize microbiome. Microbiome 9, 171 (2021). https://doi.org/10.1186/s40168-021-01118-6