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求索回眸5:利用“”酵母菌偷糖”提高纤维素酶活性

已有 714 次阅读 2020-12-18 09:34 |个人分类:科研感悟|系统分类:科研笔记

 纤维素酶研究起因 

  2000年左右,秸秆焚烧流行,对环境污染严重。据电视新闻报道,因秸秆焚烧浓烟笼罩,成都双流机场等多处机场飞机无法降落。政府采取各种措施禁止焚烧秸秆。当时,陕西省农牧厅下属的陕西省土壤肥料总站负责人是资环学院校友,建议我进行秸秆快速腐解还田研究。如果能快速腐解,秸秆就不用焚烧,还田后还能增加土壤有机质,提高土壤肥力。

 我查阅了大量资料,得知秸秆的主要成分是纤维素,是葡萄糖通过β-14键连接而成的大分子,与淀粉的化学结构类似,只是化学键不同,淀粉为α-14键。如果能将秸秆纤维素的化学键打开,产物是葡萄糖,则可获得大量葡萄糖。1亩小麦、水稻的秸秆产量大约为500kg,如果将秸秆水解转化为葡萄糖,则是十分可观的资源。于是,我满怀信心投入秸秆利用研究。要将秸秆水解为葡萄糖,必须要有活性很高的纤维素酶。

细菌和放线菌的纤维素酶活性确实很低

 根据已有研究报道,真菌是纤维素酶的主要产生菌。其中,木霉的纤维素酶研究较多。文献中关于细菌、放线菌的纤维素酶研究很少,认为这两种菌的纤维素酶活性低。

 我对这一结论持怀疑态度。我认为,自然界的大量秸秆能快速腐烂,与多种微生物有关,细菌、真菌及放线菌都参与了秸秆腐解,因此,细菌和放线菌不可能不产纤维素酶。过去可能对细菌和放线菌重视不够,导致相关文献很少。

 我的秸秆利用研究从纤维素酶产生菌的分离筛选开始。

 我带着学生采集农场打麦场旁边的腐烂小麦秸秆,农田旁的腐烂玉米秸秆,以及能找到的各种植物腐烂秸秆,作为纤维素分解菌的分离源;用滤纸作唯一碳源,分离所采样品中的纤维素分解细菌,真菌及放线菌。采用这一方法,我们分离到了大量能在滤纸上生长的细菌、真菌和放线菌。在进行纤维素酶活性测定时,发现细菌、放线菌能合成纤维素酶,但纤维素酶活性确实很低,其中,细菌的纤维素酶多为细胞表面酶,即细菌很“吝惜”,“不愿”将其合成的纤维素酶释放到环境中,紧紧的“抱”在细胞表面,只有当秸秆与细菌接触,与细菌细胞表面的纤维素酶接触时,纤维素酶才能发挥水解作用。因此,细菌酶制剂水解纤维素时产生的单糖很少,表现出纤维素酶活性很低。放线菌所产纤维素酶与细菌类似,活性很低。

 真菌产纤维素酶,真菌合成的纤维素酶为胞外酶,真菌对纤维素酶的持有“态度”与细菌恰恰相反:真菌“慷慨大方”,将其合成的纤维素酶全部分泌到环境中,释放到环境中的酶与秸秆广泛接触,水解反应“机会”多,水解反应充分进行,产生的葡萄糖数量多,纤维素酶表现出很强的降解活性。我们的试验结果证实了文献报道是正确的:真菌所产纤维素酶活性高,细菌和放线菌的纤维素酶活性低。纤维素酶制剂生产只能依赖真菌。

 从此,我放弃了对细菌和放线菌纤维素酶的研究,专注于真菌纤维素酶产生菌筛选和酶活性提高研究。这件事,反映了我对书本文献的怀疑态度:从不尽信书,实践出真知。

让“酵母菌偷糖”,提高纤维素酶活性

 为了提高纤维素酶活性,我做了大量探索。文献报道,真菌纤维素酶活性之所以低,是因为利用真菌进行纤维素酶生产时,已合成的纤维素酶会水解底物,产生大量葡萄糖等单糖。当纤维素酶产生菌周围环境中的单糖数量达到一定水平时,就会阻遏真菌继续合成纤维素酶。

 通俗讲,真菌也很“聪明”,真菌之所以要合成纤维素酶,是出于无奈:因为它周围的营养物质是纤维素,真菌无法直接吸收利用,必须将其先分解成葡萄糖等小分子糖,这就需要纤维素酶。真菌合成纤维素酶是要付出代价的,真菌“不愿”轻易启动合成反应。只有当环境中缺少单糖,不能满足真菌生长繁殖需要,就需要纤维素酶进行水解反应,“制造单糖”,此时,纤维素酶产生菌才会启动酶蛋白合成机制,合成纤维素酶。当纤维素酶大量合成,纤维素酶水解的单糖大量增加,环境中单糖含量很高,能满足产酶真菌生长需要时,产酶真菌就会感觉到“糖已够用了,不需要纤维素酶了”。当产酶真菌得到这个“指令”后,就会立即“关闭”纤维素酶合成“生产线”,停止纤维素酶合成,最终导致发酵产物中纤维素酶含量停止在较低水平,最终的酶制剂酶活性低。

 产酶真菌为了节约资源,对纤维素酶的合成量进行高效调节,所以,纤维素酶制剂的酶活性存在“天花板”,无法大幅度提高。只有解除了产酶真菌对纤维素酶合成的反馈调节,才能大幅度提高纤维素酶的合成量,酶制剂的活性自然提高。

 解除水解形成的小分子糖对纤维素酶合成的反馈阻遏,是一个十分困难的问题。

 当知道了这一信息时,我就有了思路:“欺骗产酶真菌”。即不断从真菌周围环境中将纤维素酶分解纤维素形成的葡萄糖等单糖去掉,降低单糖含量,让真菌“感觉不到”有大量单糖存在,让真菌时时感觉到单糖缺乏,有生存危机,这样,产酶真菌就会加倍努力,不断合成纤维素酶,用来解决它感觉到的单糖缺乏危机,进而,解除单糖增加对纤维素酶蛋白合成的阻遏作用,在此条件下,真菌就会源源不断合成纤维素酶,无疑提高了单位发酵产物中的纤维素酶蛋白数量。纤维素酶合成愈多,发酵产物的酶活性愈高,亦即提高了纤维素酶活性。

 在不中断发酵的条件下,从发酵产物中不断“偷走”真菌分解纤维素形成的单糖,并不是一件容易的事情。

 我想出了一个巧妙的办法:向产纤维素酶的真菌发酵培养基中接入少量酵母菌。酵母菌不能利用纤维素,只能利用葡萄糖等单糖。当真菌发酵产物中有单糖产生时,产酶真菌首先要消耗一部分,剩余单糖就被酵母菌很快消耗了,导致产酶真菌周围环境中始终没有多余单糖累积,就不会产生单糖累积对纤维素酶合成的阻遏作用了。

 这个思路是否正确,这个想法能否成功,我和我的研究生司美茹设计了一个利用酵母菌“偷单糖”的发酵产酶试验:在接种产酶真菌黑曲霉的固态发酵培养基中,接入少量酵母菌,培养一段时间,测定发酵产物的纤维素酶活性,结果令人振奋:在发酵产物中,纤维素酶系中的滤纸酶活性提高36%,淀粉酶活性提高了41%,产酶高峰期提前24小时。

 为了确认“酵母菌偷糖能提高纤维素酶活性”的结果是正确的,“偷糖提高纤维素酶活性”作用确实存在,我让研究生涂璇进行了进一步的验证试验,也得到了类似结果:

加入酵母菌后,纤维素酶系中的滤纸酶活性、微晶纤维素酶活性及羧甲基纤维素酶活性最高分别增加51%332%300%,证明用“酵母菌偷糖”的办法,可解除单糖对纤维素酶和淀粉酶合成的反馈阻遏,显著提高纤维素酶和淀粉酶活性。

 为了证明发酵产物的纤维素酶活性提高是酶蛋白合成量增加所致,我们用考马斯亮蓝法测定了发酵产物中的可溶蛋白总量变化,发现,“酵母菌偷糖”后,黑曲霉发酵产物中的细胞外可溶蛋白质含量增加了35%,即纤维素酶活性的增加,确实是酶蛋白合成量增加的结果。

 司美茹的研究结果以《混合发酵对纤维素酶和淀粉酶活性的影响》为题发表在《西北农林科技大学学报(自然科学版).20025期,涂璇的研究结构以《多元混菌发酵对纤维素酶活性的影响》为题发表在《工业微生物》200434卷第1期。截止2020.12月,第一篇论文的引用量67次,下载量642次,第二篇论文的引用和下载量分别为74901次。  

 纤维素酶制剂用量很大。利用“酵母菌偷糖”提高纤维素酶、淀粉酶活性的思路如果能广泛应用于酶制剂工业生产,将产生重大的经济效益。

 




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1 宁利中

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