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[转载]传染病背后的科学——“N个第一”的诞生(3)

已有 833 次阅读 2020-7-25 17:43 |个人分类:医学史话|系统分类:科普集锦| 传染病学, N个第一, 防治进展 |文章来源:转载

5 “细菌致病理论”引领下的“人类健康革命”

“细菌致病理论”建立至今的150年内,人类通过对传染病的认识而逐步完善的公共卫生系统,特别是通过疫苗和抗菌药物的使用,使人类的平均寿命延长了40年以上。我们从历史发展的长河中不难看到:自19世纪末至20世纪初所诞生的、与人类健康密切相关的N“第一”,无不都是在“细菌致病理论”的引领下获得的突破的。而这些从无到有的“第一”,又无不都是一颗蕴含着极强生命力的“种子”,它们随着生命科学和生物技术的快速发展,都已经成长为“参天大树”(多样性药物的产品树)。在这样的“参天大树”的呵护下,人类才有了今天。但是,我们也不难看到:有些“第一”已经被淘汰,有些则逐渐地在退出历史舞台,但它们永远是“第一”。以下对这些冠以“第一”的说法也许会有不同的观点,但至少作者是在大量文献的基础上归纳总结得出的结果,相信大多数学者或读者是会相信的。

5.1 第一剂白喉抗毒素(抗白喉血清的诞生——开创传染病控制新时代引领抗体药物的诞生

白喉是一种由白喉棒状杆菌引起的急性呼吸道传染病,主要影响5岁以下的儿童,即使在近几年,在地方性流行区,白喉的报告病死率仍超过10%

白喉棒状杆菌通过呼吸道传播,定植在人的上呼吸道,在咽部产生了一种白色的膜性渗出。这种假膜脱落常导致儿童气管急性堵塞而死亡,白喉还会引起心肌脂肪变性及外周神经损伤。图24所示为白喉患者的照片。

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24 2019年尼泊尔一名14岁女孩确诊患白喉[33]

历史上白喉一直是最令人恐怖的儿童期疾病之一。白喉从18世纪才开始大规模暴发,19世纪末期随着工业革命和城市人口的增加,出现了严重的反复暴发,夺去了数万儿童的生命,19世纪80年代白喉在欧洲和美国暴发的流行尤为严重,一些地方的病死率高达50%。但这一致死率到第一次世界大战期间下降到了15%,第二次世界大战期间进一步下降到5%左右,主要归功于抗毒素血清疗法的使用。

5.1.1 白喉棒状杆菌是如何被发现?

很难明确白喉最早是由谁发现的。但是,皮埃尔·布雷托诺(Pierre Bretonneau17781862,图25)一名法国大革命时期培养的医生。他在1818年开始学习白喉的时候,也正是这种疾病始流行的时候。1821年他给它起了现在的名字叫白喉diphthera”,这个词来源于希腊,其寓意是“毛皮或皮革”,因为患者的特征是在喉咙黏膜上形成一层膜。他在1825年,对白喉患者进行了第一次成功的气管切开术,寻找致病的原因。并于1826年出版了以“白喉”为书名的专著(25)。Bretonneau也是第一个提出“伤寒热”是由一种“特殊的实体”(a specifific entity)造成的,并用"dothienenteritis"一词来表述,但后来用了一个比较简单的词typhoid”。这从某种角度上讲,在巴斯德20年前,他已经提出了一种疾病的细菌理论。图25所示为他的专著和纪念邮票[34-35]。但是,由于在他专著中对白喉致病的描述有些“混乱”,并没有真正说服他的同事。可渐渐地,他的观点深入人心。直到60年后,科赫实验室的克雷伯(26)于1883年和莱夫勒于1884年的研究报道后才被广泛接受,白喉一词也一直沿用至今[36]。克雷伯进行了很多感染性疾病的病因学研究,为科赫法则的建立起到了很大的作用[37]

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25 皮埃尔·布雷托诺(17781862、专著及纪念邮票

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26 克雷伯(18341913 

当时微生物学在巴斯德、科赫等的带领下迅速发展,1883年人们从白喉患者的假膜中找到了白喉的病原体——白喉棒状杆菌,但刚开始一直搞不清楚其致病原因。1884年,科赫实验室的莱夫勒(Friedrich Loffler18521915年)发表论文认为白喉棒状杆菌可能会产生一种强烈的毒素分布到全身从而导致生病和死亡,确认了白喉杆菌就是白喉的致病菌。1887年莱夫勒报道了一种不致病的白喉棒状杆菌,他推测这是因为这类细菌不分泌毒素的关系。1888年,巴斯德实验室的罗克斯(Emile Roux,18531933年,图27)和后来发现鼠疫杆菌的耶尔森(Alexandre Yersin18631943,图28)受莱夫勒的启发,他们将含白喉棒状杆菌的培养物通过一个过滤器,将细菌过滤掉,再将过滤得到的成分接种到动物体内,结果发现动物发生了除咽喉分泌物外的其它所有白喉相关症状,从而证实了莱夫勒关于分泌型毒素的猜测,并顺理成章成功分离到了白喉毒素。现在我们已经清楚,白喉棒状杆菌从呼吸道侵入并定植在鼻咽部黏膜表面进行生长繁殖,其释放的毒素引起周围细胞的坏死和组织炎症,其灰白色的假膜就是由坏死的组织、细胞以及细菌聚集在一起形成的。虽然巴斯德以在1885年发明狂犬病疫苗而著称,但他的实验室未能成功得到使动物免于白喉毒素的袭击的疫苗或药物,这个问题的解决还是要回到科赫的实验室。

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27 1933年法国报纸L'Illustration刊登的摄于罗克斯(1853193370岁的时候,前排正中即罗克斯

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28 亚历山大·耶尔森(18631943

5.1.2 白喉抗毒素是如何诞生的——埃米尔·阿道夫·冯·贝林

埃米尔·阿道夫··贝林( Emil Adolfvon Behring18541917,图29左),1874年他进入柏林注明的陆军医学院,并在1878年取得学位后继续服兵役数年。18811883年,他对碘仿的作用进行了重要的研究,发现碘仿不会杀死微生物,但可以中和微生物释放出的毒素,从而具有抗毒作用,于1882年发表了第一篇关于这些问题的著作。贝林的能力由此被注意到,并被派往波恩进行实验方法的培训,于1888年被派往柏林国立卫生研究所工作,成为著名细菌学家科赫的助手,后又随科赫转到柏林传染病研究所工作,开始进行白喉、破伤风、炭疽等传染病的预防治疗研究。在炭疽杆菌的实验中,贝林发现,实验中有一些曾感染过并治愈的小鼠不会被炭疽杆菌再次感染。他早年时曾经观察到碘仿无法杀死微生物,但是能中和微生物释放的毒素,这给了他灵感,他猜测或许小鼠体内因为初次感染产生了一些物质,而这些物质能帮助它们抵抗感染。循着这个思路,贝林和同事们用白喉和破伤风的减弱型菌株注射大鼠、豚鼠和兔子,这些动物产生的血清被注射到先前感染了完全致命细菌的健康动物体内,发现血清同样可以在这些疾病取得疗效。贝林将血清中的抵御感染的物质命名为“抗毒素”,这就是我们现在所知的“抗体”[38]

经过坚持不懈的努力,1890年,他和他的大学朋友埃里希·韦尼克(Erich Wernicke)一起研制出了第一种有效的白喉抗毒素血清。同时,他还与北里柴三郎(Kitasato Shibasaburo18521931,图29中)共同研制了一种有效的破伤风治疗血清[39]1891年,贝林用免疫后的羊血清成功治愈了一例柏林的白喉患儿,为人类征服白喉迈出了重要的一步。随后白喉抗毒素血清的大规模制备是通过马来制备的,这也是在历史上有记载的(图30所示为历史上用刻画记载的马血清制备过程)[40]。在此之前,德国每年有超过5万名儿童死于白喉。因而,把抗白喉血清比喻为“扼杀白喉的天使”(strangling angel)。在白喉血清发明的最初几年里,由于抗毒素浓度不够高,这种疗法没有取得成功的突破,直到上文提到过的细菌学家保罗·埃尔利希(29右)开发了浓缩技术,并制定了精确的定量和标准化方案,才使得抗毒素的质量有了保障。

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29  埃米尔·阿道夫·贝林(18541917(、北里柴三郎(18521931(和保罗·埃尔利希(18541915(

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30 历史上用刻画记载的马血清制备过程

1892年,贝林与法兰克福的化学制药公司Hoechst开始合作,从1894年起,Hoechst开始生产和销售白喉治疗血清。但贝林研制的治疗血清对白喉的预防作用很短。1901年,贝林第一次使用了减毒的白喉棒状杆菌进行主动免疫,他希望能够刺激身体自身产生抗毒素。作为免疫应答体液理论的支持者,贝林相信血清中发现的这些抗毒素具有长期的保护作用,现在我们已经很清楚,主动接种疫苗能刺激产生抗毒素(抗体)的细胞充分发挥作用。1901年,第一届诺贝尔奖的生理学或医学奖颁发给了47岁的贝林,以表彰他对白喉、破伤风等的血清疗法和白喉抗毒素发明的杰出贡献[39]

1913年,贝林公开了他的白喉保护剂T.A.(Toxin Antitoxin,毒素-抗毒素),它含有白喉毒素和治疗血清抗毒素的混合物。这种毒素的目的是引起身体轻微的一般反应,但不伤害接种疫苗的人。此外,它的目的是提供长期保护。这种新药在不同的诊所进行了测试,证明是无害且有效的,至此危害人类健康千年之久的白喉,在贝林的努力下终于被攻克了。

贝林当时对抗破伤风血清的研究没有成功应用于人的防疫,但是,在1895年,埃德蒙诺卡德(Edmond Isidore Etienne Nocard18501903,图31)报道抗破伤风血清在马身上获得了成功。诺卡德还对动物肺结核与人类肺结核的关系感兴趣,他研究了狂犬病的延髓损伤以及破伤风、炭疽、霍乱和鼻疽等。如今有一种放线菌命名为诺卡菌,可在人及多种动物引起慢性全身肉芽肿传染病,诺卡德于1888年从牛身上分离并报道了这种病菌,是关于该种属细菌的最早报道1898年,他发现了鹦鹉热的致病菌,因此这种病也被称为诺卡病[41-42]

在贝林之前,人们关于免疫学的理论还没有建立起来,对抗细菌性疾病的主要方法是寻找或制造直接杀伤病菌的物质,而贝林发明的“抗毒素”血清,是人类历史上第一个抗体药物,通过激发和运用机体自身的力量治疗疾病,开创了免疫治疗的先河,奠定了免疫学的理论基础[4]。由于白喉主要发病于儿童,而破伤风当时在军队里的死亡率很高,因为这是一种在土壤中广泛存在的厌氧菌,受伤的战士容易被感染,侵袭机体的破伤风杆菌能够产生大量的神经毒素造成死亡。所以,抗白喉毒素血清和抗破伤风毒素血清的应用,使儿童和伤员的死亡率大幅下降。由此,贝林也被称之为“儿童与伤员的救世主”(savior of children and wounded soldiers[43]。图32所示为抗白喉血清从发现到应用的时间进程,及主要人物和事件,包括破伤风疫苗的成功应用。图33所示为目前已知的“毒素-抗毒素”免疫防治的基本原理和分子机制[44]

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31 埃德蒙诺卡德(18501903纪念邮票[42]

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32 “儿童与伤员的救世主”贝林所作贡献的时间进程[39]

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a:炭疽毒素与细胞受体ATR/TEM8CMG2结合,即经过蛋白质水解并合成毒素复合物。复合物被内吞,活性亚单位从内涵体转移到细胞

质中,在细胞质中发挥作用于目标分子。对于炭疽毒素,抗毒素可以从几个方面发挥作用,包括可溶性受体诱饵和抗PA抗体可阻止毒素结合细胞受体,弗林酶抑制剂hexa-D-Arg阻断蛋白质水解过程,抗LF的抗体和多价抑制物PVI可抑制毒素复合物的组装,PA的显性负性抑制剂DNIPA可阻断内涵体移位,小分子底物类似物抑制毒力因子EFLF对其细胞靶点的催化活性。b:肉毒杆菌神经毒素(BoNTs与胆碱能神经末梢的受体结合,被细胞内吞后从内涵体转移到胞浆从而降解靶标蛋白。抗体的作用包括:可溶性受体类的抗毒素可以抑制毒素与神经末梢受体的结合,小分子和底物类似物能够抑制蛋白质水解活性。c:蓖麻毒素与脂类分子和蛋白质上的糖基结合,能由多种内吞途径通过高尔基体进入内质网(ER,再利用Sec61p转运蛋白从内质网进入胞浆并作golgi用于靶分子。抗毒素的作用包括使用抗体抑制毒素与细胞受体的结合,小分子和底物类似物阻断毒素对核糖体RNA的降解。

33 “毒素-抗毒素”免疫防治的基本原理[44] 

5.2  第一剂征服白色瘟疫疫苗的发现和应用

5.2.1 抗结核病疫苗是如何诞生的——Albert Calmette和CamiIIe Guerin

抗白喉血清和抗破伤风血清疫苗的成功,引领着一大批防治传染病的疫苗相继诞生。结核病是一种严重的空气传播性疾病,在19世纪,肺结核占全部人口死亡原因的四分之一,也被认为是19世纪病。1882科赫鉴定出了结核分枝杆菌是导致结核病的病原体,从而开启了结核病的预防和治疗历史[46]。结核病感染表现为复杂的免疫反应,宿主与病原之间具有独特的相互作用,导致其治疗和控制非常困难。此外,结核病是一种与贫困有关的疾病,往往带来沉重的社会负担。迄今为止,卡介苗(BCG)是目前唯一可用的预防结核病的疫苗,已经使用了90多年,已经接种了超过40亿人,有着惊人的安全记录[47]

卡介苗的历史始于两位法国科学家阿尔伯特·卡尔梅特(Albert Calmette18631933)和卡米尔·盖林(CamiIIe Guerin18721961(34)。他们从1905年起就一直致力于研制抗结核疫苗,BCGBacillus Calmette-Guerin的缩写,意思是CalmetteGuerin的杆菌,它是由一种减毒的牛型结核杆菌的变种所制成的活疫苗,给儿童口服或注射接种后,对预防结核病有相当大的效果。

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34 阿尔伯特·卡尔梅特(18631933(和卡米尔·盖林(18721961(

1905年至1918年间,卡尔梅特和盖林对结核病感染机制进行了研究。他们先是证明对动物使用小剂量注射和减毒的结合杆菌可用于牛和不同种猴子的结核病保护性疫苗,后来他们开始培养结核杆菌,并发现连续传代培养削弱了结核杆菌的致病能力。卡尔梅特和盖林选择了一株高致病力的牛结核杆菌,通过每三周传代一次的连续培养来削弱其毒力,这项研究在第一次世界大战期间不得不停止,但于1918年恢复。到1921年,结核杆菌已经被传代培养了230次,终于使该菌种接种于动物后,不发生结核病,却保留着对结核病产生免疫作用的抗原性[48]

卡介苗于1921年首次在人类身上使用,当时维尔·黑尔博士(Dr Weil-Hale)在巴黎给一名婴儿口服了6mg卡介苗,孩子的父亲死于肺结核病,其母亲也患有肺结核,分娩后即去世。孩子由同样患结核病的家人抚养长大,接种卡介苗后发育为一个健康的男孩,卡介苗大获成功。1921年到1927年,共有969个孩子接种了卡介苗,根据卡尔梅特博士的统计,接种儿童比不接种儿童死于结核病的概率大大降低[49]。但关于卡介苗的安全性当时还没有足够的数据,即使发明它的卡尔梅特博士也担忧在一个生物体内存活了一段时间的卡介苗弱毒杆菌是否会再次恢复强的毒力。

1929年发生了吕贝克事件,更加重了人们对疫苗安全性的质疑。当时,德国西北部城市吕贝克的市立医院将从巴黎引进的卡介苗菌种培养制造疫苗,由于当地操作人员的疏忽,误把一种毒性很强的人型结核菌混入菌苗之中,接种到252名新生儿身上,结果导致其中72名婴儿患上结核病并死亡。

虽然随后的调查搞清楚了事情的原委,但由于人们对该事件的恐惧,在接下来的几年里卡介苗的接种率急剧下降,直到第二次世界大战期间肺结核的复发,卡介苗再次被大规模使用,公众对其安全性的信心才得到恢复。

5.2.2 抗结核病防治的艰巨性

据统计:2016年新增感染病例高达1400万人,其中死亡人数达130万,超过全球HIV/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的死亡人数;在HIV/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)死亡人数中,有37.4万死于肺结核[50]。为此,世界卫生组织于2017年,将其列为需要最优先进行研究和药物开发的行列中。

在卡介苗之后人们发明了链霉素、异烟肼、利福平等药物,可以杀死结核杆菌,人们以为可以“高枕无忧”了。其实不然,结核病的防治似乎比其他传染性疾病的防治更为艰难。其主要原因有以下两个。一是,尽管卡介苗从20世纪20年代末开始在全世界推广,但直到目前为止,关于结核病的预防一直存在许多争议,其中之一就是关于卡介苗的效力或有效性。在各种临床试验中,卡介苗的有效性从80%保护到没有保护作用,相差悬殊,而造成这些差异的原因仍然不清楚,因此卡介苗及结核病预防的历史都还远没有结束[51]。二是,近年来出现的多重耐药结核分枝杆菌成为全球性的公共卫生问题:一方面,这种细菌可以在被感染的机体内处于长期的“休眠”状态难以被彻底清除[52];另一方面,这种细菌对抗结核分枝杆菌的药物具有“持留性”耐药,即在药物杀死绝大部分细菌的同时,难以把极少部分的细菌彻底杀死,我们把这部分细菌称作为“持留菌”,从而导致一旦停止用药,则这一部分细菌会“死灰复燃”而使结核病复发;结核分支杆菌的这种耐药特性,对新药的开发提出了很大的挑战[53]

5.3 第一枚魔弹砷凡纳明的发明——引领现代化时代的到来

5.3.1 第一枚魔弹的发现——Paul Ehrlich

当保罗·埃尔利希(Paul Ehrlich1854–1915,图35)还是一名医学生时,他一直痴迷于有机化学和染料,并不断研究这些问题,他详细阐述了有关发现“魔术子弹”的理论,这种“魔术子弹”能够特异性破坏肿瘤细胞和微生物。在实践中,他直觉认为这种染料会破坏寄生虫,因此他将亚甲基蓝用于治疗疟疾患者。他创造了被称之为“第一枚魔弹(the first magic bullet”的、真正有效的控制人类梅毒的化合物——砷凡钠明(化合物606Salvarsan[54]。图35所示为埃尔利希最早有关606的实验记录。

19世纪的德国光学工业及染料工业十分发达,有关染料的研究在全世界遥遥领先。医学和生物学方向的研究人员纷纷尝试用各种染料对生物组织和细胞进行染色。保罗·埃尔利希19世纪70年代在莱比锡大学医学院求学时就对化学染料着迷,研究如何使用不同的染料对不同细胞或病原体进行着色,以便在显微镜下分辨,用于诊断疾病。1878年,埃尔利希获得博士学位之后,受聘于柏林Charité医院,并继续开展染料的研究工作。1882年,科赫宣布发现结核杆菌,但染色总是不太理想,埃尔利希立即着手寻找更灵敏且选择性更佳的结核杆菌染色方法,在无数次实验之后,终于开发出了能够在显微镜下清晰观察到结核杆菌的“抗酸”染色法,成为当时结核病诊断的主要方法之一。甚至,在1887年初,他还用自己开发的新方法对自己的唾液进行染色,发现自己不幸染上了肺结核。在埃及休养两年后,埃尔利希于1889年返回德国,继续从事染料研究。

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35 保罗·埃尔利希(1854–1915及其最早有关606的实验记录

在开展染色研究的过程中,埃尔利希注意到,不同染料对不同细胞、微生物及其内部细胞器的附着具有选择性,从而使被染色对象呈现不同颜色。埃尔利希进一步设想,既然某些染料可以特异性地结合病原体并将其染色,而对人体细胞没有亲和力,那么是否某些染料可以选择性地吸附在病原体上并将其杀死,而不附着人体细胞?在当时,人们对于微生物已经有了一定的认识,且已有许多微生物及原生动物导致的疾病的病原被确定,若能寻找到能够特异性吸附并杀死病原体的染料,则可以用来治疗相关疾病。顺着这一思路,埃尔利希继续开展染料的研究并将注意力集中在染料的治疗能力上,并在1890年发现能够将疟原虫染色的亚甲基蓝对疟疾有一定疗效。这一发现对埃尔利希的科学生涯起了决定性作用,坚定了他寻找能够特异性杀伤病原体的“魔术子弹”的信念。

1899年,埃尔利希担任新成立的法兰克福皇家实验治疗研究所所长,并将研究集中在利用化学药物治疗传染病的研究上。埃尔利希团队首先想要攻克的是“非洲昏睡病”,彼时人们已经明确这一疾病是由锥体虫引起的,但是没有有效的治疗药物。

在测试数百种化合物之后,埃尔利希团队在1904年发现了一种红色染料——锥虫红,能够杀死小鼠体内的锥体虫,且没有明显的毒性。但锥虫红在人体中的试验中效果并不理想,从而被搁置,埃尔利希也继续寻找新的染料。此前不久,有英国医生发现有机砷化合物阿托西尔(atoxyl)对人体内的锥体虫效果很好,但有致盲的严重副作用。埃尔利希从以往的经验判断,认为阿托西尔能够杀死锥体虫是由于能够特异性地与锥体虫结合,但致盲的副作用则是由于恰好同时能够与人体细胞结合。埃尔利希相信,通过对阿托西尔进行结构修饰,将可能保留其药效的同时降低对人体的毒性。之后埃尔利希团队合成了上千种阿托西尔结构衍生物,并展开了对锥体虫的活性研究,但其中并没有什么有效的化合物。

当时,有学者发现了苍白密螺旋体是导致梅毒的病原体,因此,埃尔利希决定从合成出的众多化合物中找到一种能够有效破坏梅毒螺旋体的药物。

其时,埃尔利希的老同事北里柴三郎将他的学生秦佐八郎(Sahachiro Hata18731938,图36)送来实验室工作,而当时秦佐已开发了用这种螺旋体感染兔子的方法,于是,埃尔利希让秦佐开展与治疗梅毒有关的研究[55]1909年,秦佐发现,在之前合成的阿托西尔衍生物中,编号为606的衍生物——砷凡纳明对感染梅毒的家兔有治疗作用。随后,在黑猩猩和人体的实验也获得成功,606的发现在世界上引起了轰动,191011月,埃尔利希将606命名为洒尔佛散(Salvarsan,化学名:二十二氧基亚砷酸苯)并推向市场,成为第一款能治疗梅毒的有机化合物,人们终于摆脱了使用无机汞化物治疗梅毒的历史。606是历史上第一种抗菌化学药物。是人类首次目的明确地针对致病微生物,且成功通过修饰先导化合物得到有效抗菌药品的尝试,因此埃尔利希也得到了“化学疗法之父”的美誉。埃尔利希用Salvarsan成功治疗梅毒,刺激了人们寻找其他化学物质来对抗传染病,引领现代抗感染药物治疗时代的到来。图36所示为1909年拍摄的埃尔利希与秦佐的合影、埃尔利希1914年的办公室,及当时使用的洒尔佛散注射器和使用说明[56]

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36 1910年左右拍摄的埃尔利希与秦佐的合影、埃尔利希1914年的办公室及当时使用的洒尔佛散注射器和使用说明[57] 

5.3.2 现代免疫学的奠基人——保罗·埃尔利希

保罗·埃尔利希(Paul Ehrlich)不仅作为制造“魔弹”的第一人,现代化疗的奠基人[58],他还被公认为是许多医学领域的先驱者,随着时间的流逝,他在组织学,免疫学,肿瘤学和血液学等学科的建立和发展中所扮演的角色逐渐得到认可。特别是在免疫学方面,他毋庸置疑地占据着3个第一的位置:首先是,展示了如何得高滴度的抗血清,将定量方法引入免疫学,并用立体化学的术语定义了抗原-抗体相互作用;第二是,帮助阐明了免疫溶血的机制,他引入了细胞表面受体的概念,并进行了第一次实验来显示母婴和新生儿之间的免疫关系;第三是,他第一个提出了抗体形成的选择性理论,及其与之相关的免疫调节机制。埃尔利希也由于其在免疫学方面的工作于1908年获诺贝尔生理及医学奖。埃尔利希是一个集完美的实验科学家与富有想象力的理论家于一体的伟大的科学家[54]。图37所示为埃尔利希及其根据“侧链理论”绘制的抗体形成和效应功能,及特异性抗体与在粒细胞摄取脑膜炎球菌中的非特异性吞噬细胞之间的协同作用[59]

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37 保罗·埃尔利希Paul Ehrlich及其根据“侧链理论”绘制的抗体形成和效应功能(A和特异性抗体与在粒细胞摄取脑膜炎球菌中的非特异性吞噬细胞之间的协同作用(B[59] 

保罗·埃尔利希的一生充满着对科学的激情,特别是对现代药学的发展做出了极其重要的贡献。图38所示为其一生科研生涯中的主要学术成就。他100多年前的这些成就,引领着我们现代医学和药学发展,都是具有里程碑意义的重大发现和发明[57]

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38  所示为埃尔利希一生科研生涯中的主要学术成就[57] 

5.4 第一个抗菌药物磺胺发明——现代抗菌药物治疗时代的诞生

5.4.1 黎明前的黑暗是如何打破的——Gerhard Johannes Paul Domagk

20世纪初,致病菌是人类的一大敌人,科学家一直试图寻找各种对病菌有效的物质。1910年,当德国科学家埃利希以砷苯化合物为基础,合成了对梅毒有极好疗效的二氨基二氧偶砷苯(砷凡纳明)时,人们以为:这下可以战胜细菌了。然而,这个希望落空了,砷凡纳明对细菌没有任何作用。正当人们在细菌性疾病面前束手无策时,又一位德国科学家杜马克(Gerhard Domagk18951964,图39)第一个攻破了这个难关。他发明了人类第一个对抗细菌的药物——百浪多息,从此,开创了细菌感染化学治疗的新纪元[60]。

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39  杜马克(18951964

1927年是杜马克生活道路上的一个重要转折点。他被任命为Bayer研究所病理学和细菌学主任。当时,全球医药界掀起了一股合成新的有机药物的高潮。杜马克担任实验室主任后,致力于探索某些染料应用于医学上的可能性。他先后合成了1000多种偶氮类染料,并测试这些染料在试管中对酿脓链球菌的杀菌效果。如果染料在体外具有杀菌作用,他将进一步用小鼠进行试验。将酿脓链球菌注射到小白鼠体内,使小白鼠感染而患上败血症,然后再次试验该染料的杀菌活性。然而,始终没有筛到期盼的抗菌化合物。

在无数次失败之后,奇迹终于发生。那是1932年的圣诞前夕,杜马克发现一种在红色染料能够使受细菌感染的小白鼠康复。这种救活小白鼠的红色染料,早在1908年就由I.G.FarbenindustrieFritz Mietsch Joseph Klarer合成,名为“红色百浪多息”(prontosil rubrum)。由于它能快速而紧密地与羊毛蛋白质结合,常被用来染色纺织品和皮革。因为“百浪多息”中含有一些具有消毒作用的成分,所以曾零星地有用于丹毒等疾患的治疗。杜马克发现百浪多息的药用价值后,首先以“杀虫剂”申请了专利,同时开展进一步研究。直到1935的第一次报告,使他成为世界学术界的“名人”[61]

5.4.2 “前药”概念的提出——开创药物化学研究新领域

“百浪多息”是一种含有多种成分的红色染料。究竟是哪种成分对链球菌有杀灭作用呢?经过反复试验,杜马克从“百浪多息”中提取出一种白色粉末,即磺胺。于是,他用磺胺在狗身上进行试验。杜马克将溶血性链球菌注射到狗身上,原本活蹦乱跳的狗很快就病得大喘粗气,动弹不得了。然而当杜马克将磺胺溶液注射到狗体内后,狗逐步恢复了活力。这一实验证明:是“百浪多息”中提取出来的磺胺对杀灭溶血性链球菌发挥了作用。为了慎重起见,杜马克又在兔子等动物做了实验,均取得预期的疗效。任何药物只有临床效果才是最有说服力的。

不久,法国巴斯德研究所科学家研究揭示了“百浪多息”只有在体内才能杀死链球菌,而在试管内则不能杀菌的机理。研究发现,“百浪多息”进入体内后,被代谢分解为对氨基苯磺酰胺(即磺胺)。磺胺在结构上与细菌合成叶酸所必需原料的对氨基苯甲酸十分相似,被细菌摄取后却不能被利用,导致细菌无法合成叶酸,进而导致细菌死亡,即磺胺是对氨基苯甲酸的竞争性抑制剂。图40所示为磺胺类药物与叶酸和对氨基甲酸的化学结构比较。由此,不仅开创了现代抗菌药物治疗时代的诞生,也开拓了药物化学的另外一个新研究领域——前药的设计和开发。

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40 叶酸的组成以及对氨基苯甲酸(PABA和磺胺结构的比较 

5.4.3 最高的奖赏——拯救了自己的女儿

正当杜马克准备临床试验时,意外发生了。一天,女儿玛丽的手指被刺破并受了感染,手指肿胀,高烧不止。杜马克心急如焚,当地名医除了截肢以外也并无良策,玛丽的病情逐渐恶化成败血症,生命垂危。此时,杜马克想:应该知道女儿感染的是什么病菌。他用显微镜观察玛丽伤口的渗出液和血液,确认病菌正是酿脓链球菌。一个念头闪现在杜马克的脑中:是否可以用磺胺来治疗玛丽的感染?

磺胺还未进行人体试验,而动物试验的成功并不意味着对人有效。然而此时的杜马克别无选择,他只有冒险一试。杜马克将磺胺溶液注射进处于昏迷状态 的玛丽的体内,时间一分一秒地流逝。终于,玛丽慢慢地睁开了双眼。杜马克简直不敢相信自己的眼睛,抚摸着玛丽的前额:“简直是美妙的梦!”女儿得救!玛丽成了医学史上第一个用磺胺战胜链球菌感染的患者。杜马克自豪地说:“治好我的女儿,是对我发明的最高奖赏。”

磺胺的发现轰动了全世界。Bayer公司生产了世界上第一支磺胺药物。此后,其他国家也陆续生产。1939年,诺贝尔基金会为了表彰杜马克的重大贡献,决定授予他诺贝尔生理学和医学奖。但不幸的是,而1935年的时候,诺贝尔和平奖颁给了一位公开批评纳粹的德国反法西斯记者,这激怒了当时的德国政府,政府下令不允许任何德国人接受诺贝尔奖。纳粹强迫杜马克签名拒绝接受诺贝尔奖,并把他软禁达8年之久。

诺贝尔奖金只为得奖人保留1年,超过年限,奖金不再发放而将充入诺贝尔基金。不过诺贝尔奖的奖章和对获奖者表示敬意的仪式则可为得奖人长期保留。第二次世界大战结束后,诺贝尔基金会专门为杜马克补行了授奖仪式,瑞典国王亲自为杜马克颁发了证书和镌有他姓名的诺贝尔奖章。在授奖仪式上,杜马克作了题为《化学治疗细菌感染的新进展》的演讲[62]。

5.5 第一个霉菌代谢产物青霉素的发现——药物来源新时代的诞生

5.5.1 机遇眷顾有准备的人——亚历山大·弗莱明

亚历山大·弗莱明(Alexander Fleming18811955,图41),1906年从伦敦大学圣玛丽医学院毕业后留在母校的研究室,帮助其师赖特博士进行免疫学研究。

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41 亚历山大·弗莱明(18811955及圣玛丽医院和他当时发现青霉素的实验室大楼 

1919年,弗莱明回到圣玛丽医院全力开始了寻找抗菌药物的研究工作。弗莱明和他的助手把研究对象对准了葡萄球菌,因为这种菌分布广,危害大,伤口感染化脓主要就是由于它们在作祟。他们在一只只培养皿中接种葡萄球菌,进行人工培养,再试验各种药剂对葡萄球菌的作用,以期找到杀灭葡萄球菌的理想药物。

1922年,弗莱明在做实验时,发现了一种他称之为溶菌酶的物质。溶菌酶产生在人体内,是黏液和眼泪的一种成分,对人体细胞无害。它能够消灭某些细菌,但遗憾的是在那些对人类特别有害的细菌面前它却无能为力。其后,弗莱明完成了一个题目为《皮肤组织和分泌物中所发现的奇特细菌》的报告[63],虽然这个报告并没有引起广泛关注,但是,溶菌酶的发现为弗莱明的深入研究指明了方向,为弗莱明打开了通向发现青霉素的大门。图41为弗莱明工作的照片及英国圣玛丽医院和他当时发现青霉素的实验室大楼。

1928915日下午,长假结束后的弗莱明在实验室一边观察培养皿,一边同一位同事闲聊。突然,他发现靠近窗边一个盖子没有盖好的葡萄球菌培养皿中出现了一种青色的霉菌,它使金黄色的葡萄球菌受了污染,变得半透明,最后完全裂解了。

弗莱明意识到这种青色的霉菌可能是致人死命的葡萄球菌的克星,他立即在培养皿中刮出这种霉菌在显微镜下仔细观察,确定这种菌种是青霉菌。后来知道,这是从楼下一位研究青霉菌的学者的窗口飘上来的。弗莱明对将青霉菌接入培养基中继续培养,几天后发现青霉菌成了菌落,培养汤呈淡黄色,也有杀菌能力。于是他推论,真正的杀菌物质一定是青霉菌生长过程中的代谢物,他称之为“青霉素”。图42左所示为弗莱明偶尔发现的污染有霉菌的培养皿,其周边的细菌被抑制而不能生长了;图42中所示为至今保留在圣玛丽医学院青霉素发现博物馆的实验室照片;图42右所示为二战期间时代周刊刊登的有关宣传青霉素的图片,上面写着“感谢青霉素,他将回家!”。

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左:弗莱明偶尔发现的污染有霉菌的培养皿,其周边的细菌被抑制而不能生长了;中:至今保留在圣玛丽医学院青霉素发现博物馆的实验室照片;右:二战期间时代周刊刊登的有关宣传青霉素的图片,上面写着“感谢青霉素,他将回家!”

42 青霉素发现的图片

在此后4年的时间里,弗莱明对这种特异青霉菌进行了全面的研究,同时他也从各种容易发霉的物品中寻找各种各样的霉菌,将它们收集、培养,看这些霉菌能不能像青霉素一样,对病菌有杀灭能力。结果他发现只有青霉素是独一无二的,只有它能杀病菌,而且能杀死那些导致伤兵伤口腐烂的病菌。但他终究没有能够在他的实验室里实现青霉素的临床应用。他把研究结果于1929年在英国实验病理学杂志上发表,题目为:论青霉菌培养液对分离流感嗜血菌的作用[64]。他也在柳叶刀杂志发表了有关发现青霉素的文章,但几乎没有产生什么反响。

因为当时医学界的注意力集中在大有希望的磺胺药物上,所有别的化合物似乎只是一种“无足轻重的东西”。而且当时弗莱明在发表文章的时候并没有提到青霉素在研究初期临床上的成功应用。但是,它曾成功地治愈了一个矿工的被感染的眼睛,保住了视力。另外还治愈了一个出生时由于母亲患有淋病而感染了眼疾的婴儿,弗莱明用提取物冲洗婴儿的眼睛,使他免于眼盲。多年后被问起为什么没有发表这些治疗结果的时候,弗莱明认为当时用的是粗的提取液,没有经过充分的验证,不值得发表。如果当时能把这些成果发表的话,可能青霉素的广泛认可或许就能够提早很多年。

虽然发现了青霉素,但由于生物化学和分离纯化技术的欠缺,弗莱明始终无法提取足够量的青霉素用于实际应用,而且,弗莱明发现青霉素产生菌在他的培养条件下是不稳定,在培养8d后就停止产青霉素了。渐渐的就连弗莱明的同事也开始对青霉素丧失信心,放弃了继续研究。尽管如此,弗莱明没有轻易丢掉这株菌种,而是耐心将其传代保存,并将菌种同时送给了牛津大学同时保存。

后来的青霉素再发现,使弗莱明获得了1945年诺贝尔生理学与医学奖。他在当年的哈佛大学毕业典礼上,向两万五千名毕业生发表演讲时说:1928年的那一天,“我并没有打算让产黄青霉孢子掉在我的培养基上,但是我一看见培养基上出现的变化,就丝毫不怀疑,非同寻常的事就要发生了”。

他谆谆嘱咐哈佛学子:“千万不要忽视非同寻常的现象或事件。也许它只是一桩虚假警报,一无用处。但是,从另一方面说,它也可能是命运向你提供的导致重大进展的线索”。他还说,“头脑准备不足,就看不见伸向你的机会之手”。重大发现取决于一丝不苟的工作和有准备的头脑。

5.5.2 青霉素的再发现——Howard Walter Florey和Ernst Boris Chain

20世纪30年代的英国牛津大学,澳大利亚病理学教授华特·弗洛里(Howard Walter Florey18981968,图43)组织了一批多学科研究人员开展研究工作,这其中包括了生物化学家钱恩(Ernst Boris Chain19061979)。1933年,受纳粹威胁的俄裔犹太人钱恩从德国逃至英国,在剑桥大学霍普金斯教授(Frederick Gowland Hopkins18611947)课题组工作,并于1935年被推荐至弗洛里的研究小组。当时,临床上已经开始出现对磺胺耐药的细菌,而二战中伤员的细菌感染日趋严重。钱恩试图开设新的课题,他在查阅所有关于抗菌物质的文献报道时,不但查到了弗莱明关于溶菌酶的研究论文,而且他10年前论述青霉素的文章也被意外发现。青霉素的抗菌作用引起了他们的强烈兴趣。于是,他邀请弗洛里一起进行研究。智多识广的弗洛里立马就答应,因为在他担任英国实验病理学杂志编委时,曾经看过弗莱明的投稿文章,所以非常了解青霉素的潜在价值。他们当机立断决定重新开始研究青霉素。

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43 华特·弗洛里(1898 1968(,钱恩(19061979(和青霉素再发现的牛津团队(

在他们开始研究时,发现在牛津大学保存有当年弗莱明赠送的青霉素菌种。随后他们开始了青霉素的分离纯化工作,并开展了动物实验。1940年8月,钱恩和弗洛里等人把青霉素动物实验成果发表在《柳叶刀》杂志上[65]。图43所示为弗洛里、钱恩及其青霉素再发现的牛津团队。

10年来,弗莱明始终没有放弃过提纯青霉素的希望,但是他却不知道牛津大学正在进行的工作,当他读到《柳叶刀》上的这篇文章时,他十分惊喜。弗莱明立刻动身前往牛津大学,他想要看看弗洛里和钱恩的工作。可当弗莱明出现在弗洛里实验室时,弗洛里和钱恩也十分惊喜,他们当时还以为弗莱明已经不在人世。钱恩向弗莱明提供了一些棕色的粉末[66],之后弗莱明用这些样品评估了青霉素的临床价值并在不久后发表了相关成果[67-68]

为表彰弗莱明、弗洛里和钱恩对人类作出的杰出贡献,1945年诺贝尔基金会把当年的医学奖授予了发现青霉素的这3位元勋。在评奖过程中还有一个小插曲:部分评委认为虽然3位科学家都具备获得诺贝尔殊荣的条件,但相对而言弗莱明的贡献要大于弗洛里和钱恩,因此建议把奖金的一半颁发给弗莱明。另外一半由弗洛里和钱恩平分;但是,最终结果还是3人平分了奖金,因为大多数评委认为如果没有弗洛里和钱恩的工作,就不可能实现产业化,也就不会显示出如此重要的作用。

5.6 第一个抗结核抗生素链霉素的发现——抗生素黄金时代的到来

5.6.1 土壤之父——Selman A. Waksman

创造抗生素奇迹的另一个伟人是美国科学家塞尔曼·A·瓦克斯曼(Selman A. Waksman18881973,图44)。瓦克斯曼在1916年时的硕士论文,开始了他对土壤微生物研究的征程(44~47)。他的研究发现了另一种特殊的细菌,即放线菌,其很快就成为了发现抗生素的“摇篮”(在目前临床使用的抗生素品种中,其中70%来源于放线菌)。这种细菌早期在固体培养基生长时类似于细菌,但生长至中期时又像霉菌(产生气生孢子,图46),但又不像霉菌那样,随着培养时间的延长其气生孢子会“无限制”生长而迅速扩散污染周围(45B),这种菌不会“无限制”生长(45A),因而孢子也不会扩散——这就是产生抗生素的“摇篮”——放线菌。放线菌在液体培养基中培养时,与细菌明显不同是能够形成“丝状”,有点像真菌的液体菌丝,但它要比真菌菌丝细得多,如图44C为链霉素产生菌灰色链菌的菌丝体。后来的研究发现,这类放线菌在产生抗生素的同时,也能产生各种色素(45C);而在电子显微镜的观察下,其形成的气生孢子更是具有“婀娜多姿”的形态。

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 A:瓦克斯曼(正在检测土壤放线菌所产生的抗生素,B:瓦克斯曼正在从发酵液中提取链霉素,C:当时发现的产生链霉素的放线菌—灰色链霉菌的液体菌丝体,D:当时分离获得的链霉素的晶体

44 瓦克斯曼与链霉素

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A:放线菌(孢子不扩散B:霉菌(孢子扩散C:产生抗生素的同时产生色素

45 放线菌与霉菌的菌落形态

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46 霉菌孢子

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47 放线菌孢子

在发现链霉素之前,瓦克斯曼一直从事的是土壤微生物方面的研究,直到1932年,他受美国对抗结核病协会委托,开始研究结核杆菌落入土壤后为什么会被迅速杀死的问题,当时已有科学家意识到有可能是土壤中的其他微生物分泌了某种抗菌物质从而消灭了结核杆菌。但是经过了几年的探索,瓦克斯曼及其团队仅仅是再次证实了过去关于结核杆菌在土壤中很快遭到破坏的观察结果,他推断这很可能是由于土壤中某种微生物的作用。1939年,受到杜博斯(René Jules Dubos,19011982,图48)博士从土壤微生物中发现抗菌物质短杆菌素的启发,再加上弗莱明从青霉菌中发现青霉素的启示,瓦克斯曼教授开始专注于从放线菌中发现抗菌物质。

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48 杜博斯(19011982和他发现的产生抗生素的芽孢杆菌

很快,在美国药业巨头默克公司的资助下,在他的实验室里发现了包括链霉素在内的放线菌素、棒曲霉素、烟曲霉酸、毛壳菌素、小单孢菌素,以及灰链丝菌素。最终,由于链霉素毒性低抗菌活性强,特别是对结核分支杆菌具有强的抗菌活性脱颖而出,图44D为当时分离得到的链霉素晶体的照片。后来他建议把这些物质总命名为抗生物质(antibiotics)。

由于链霉素在临床上不仅对肺结核具有“神奇般”的疗效,对其他多种细菌感染,特别是对青霉素不起作用的、被称之为革兰阴性菌的感染具有显著的疗效。1944年,链霉素被正式用于临床。由于链霉素的发现和对结核病的疗效,1952年瓦克斯曼获诺贝尔生理学和医学奖(这是继杜马克和弗莱明后的第三位因发现里程碑式的抗生素而获奖)。而他建立的一整套较为系统的,从微生物中寻找抗生素的方法,使抗生素的寻找从经验、感性的方法进入到了理性和科学的新阶段。采用这种方法瓦克斯曼一生共发现出了20种天然抗生素,而且绝大多数是从放线菌中得到的;放线菌成为产生抗生素的最为重要的来源。至今还是一个微生物新药发现的的重要方法——Waksman平台,成就了一大批土壤微生物来源的抗生素的发现和应用,由此形成了上世纪40年代初至60年代中的“抗生素黄金时代”。目前临床应用的很多抗生素都是在那个时代发现的。

瓦克斯曼一生孜孜不倦,发表了400余篇科研论文和综述,著有27本书籍,1本自传《微生物和我的生活》。1973年,瓦克斯曼走完了他精彩的一生,静静地安息在伍兹霍尔附近的公墓内。在许多科学先驱的陪伴下,瓦克斯曼继续接受着来自世界各地无数慕名者的瞻仰。

然而关于链霉素的发现,瓦克斯曼的学生阿尔伯特·萨兹(Albert Schatz19202005,图49)作出了重大贡献。萨兹是1944年瓦克斯曼实验室发表有关发现链霉素的论文的第一作者[69],长久以来,他们二人关于链霉素发现的专利权以及1952年诺贝尔奖的归属各执一词,在他们生前未得到解决,身后也留给科学界许多讨论与思考,这也是发生在科学界“师徒”之间的恩恩怨怨的最为典型的案例。

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49 阿尔伯特·萨兹在瓦克斯曼实验室工作

在此我们对瓦克斯曼和萨兹之间的恩怨不多加评论,然而,萨兹尽管没有获得诺奖,但人生依旧精彩——人们是不会忘记的,人们最终还是崇敬他。萨兹在许多领域做了超过半个世纪的研究。他应邀在美国、加拿大、英国、瑞士、德国、瑞典、法国、意大利、西班牙、葡萄牙、保加利亚、匈牙利、智利、阿根廷、巴西和多米尼加共和国演讲。

特别是1946年,由他发起了一项研究,发现了制霉菌素,一种控制真菌和酵母感染的抗生素;他出版了3本书和700多篇文章。熟悉他的人总说:无论在哪里,他的热情、善良和幽默感都让人钦佩;他总是尽他所能帮助他的学生;他一生对人性的深切关怀是显而易见的[45,70-77]

抗生素被誉之为“医学王冠上的明珠”(The Crown Jewels of Medicine)。以青霉素和链霉素的发现应用为代表的抗生素,已经形成了一棵巨大的产品树(50),其与以白喉抗毒素血清为标志的免疫防治一起,在150年左右的时间内,由于基本控制了施虐人类的传染病,而得以我们的平均寿命延长了20年以上。但是,面对今天突如其来的“新冠病毒肺炎疫情”,每个人应该记住的是:人类与致人疾患的病毒、细菌等微小生命体之间,是一场“道高一尺、魔高一丈”和“魔高一尺、道高一丈”的 “永恒的博弈”。由此,我们更应该记住的是:敬畏自然、敬畏生命。

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50   抗生素产品树



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