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黄维院士:半导体生物传感器的应用

在生物分子检测领域,酶电极传感器是最早研制成功并广泛应用于谷氨酸、血糖、尿素、蛋白质等物质快速检测的一种传感器。随着科技的进步,利用半导体电子器件的电学性能对外加电场变化非常灵敏的特性,研究人员构建了不同结构的半导体场效应晶体管,分别实现了对不同生物分子的高灵敏、高选择性和快速响应的电子识别。常见的半导体生物传感器依据构建的材料可分为硅纳米线、碳纳米管、石墨烯以及氧化锌等半导体电子器件,而无论是哪种材料的传感器均能够实现对DNA、蛋白质、葡萄糖及核酸等生物分子的高灵敏检测。根据构建场效应晶体管材料的不同,我们将分别对硅纳米线、碳纳米管、石墨烯和氧化锌纳米线场效应晶体管对生物分子的检测性能及其应用进行简单的描述。


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基于硅纳米线的半导体生物传感器


硅纳米线作为一类重要的一维半导体纳米材料, 其自身特有的荧光、紫外等光学特性,场发射、电子输运等电学特性,热传导、高表面活性和量子限制效应等特性使其在高性能场效应晶体管、单电子探测器和场发射显示器件等纳米器件方面具有很好的应用前景。近几年,研究者以硅纳米线为主要构造单元,制备出了硅纳米线场效应晶体管,在细胞、葡萄糖、过氧化氢、牛血清蛋白和DNA 等生物分子检测领域中表现出非常快的响应速度、高的检测灵敏度和很好的检测选择性,为检测高灵敏度、微型化纳米电子生物传感器的开发提供了基础。例如,Cui 等利用硅纳米线制备了如图1 所示的硅纳米线生物晶体管,并实现了对蛋白质分子的检测。在器件的制备过程中,首先使用生物活性分子对硅纳米线进行功能化修饰,然后通过生物活性分子——链霉亲和素与相应配体−受体之间相互作用的特性将其连接到硅纳米线表面,通过配体和受体相互作用过程中对器件电性能的影响实现对被测分子的检测。检测结果表明:在实验pH 下,随着链霉亲和素的加入,表面带有负电荷的链霉亲和素与p 型掺杂的硅纳米线结合后形成静电场(electrostatic gating)效应,致使电流呈现逐渐增加的趋势;而且,检测结果还表明,生物活性分子修饰的硅纳米线传感器对链霉亲和素的检测灵敏度至少可达到10pM,远超越了纳米级别的检测范围。另外,生物活性分子修饰的硅纳米线生物传感器对单克隆抗生物素的抗原——抗体也表现出非常好的检测特异性。然而,由于单克隆的生物活性分子表面带有负电荷,其电导率随着抗体的加入而呈现逐渐减小的趋势。研究人员采用未经任何修饰的硅纳米线器件对单克隆抗生物素、表面修饰的硅纳米线电子器件对免疫球蛋白G 进行检测特异性分析也证明硅纳米线电子器件具有良好的检测特异性。


图1 (a)生物活性分子修饰的硅纳米线;(b)生物活性分子——链霉亲和素


在癌症患者的体内,必定会存在某种特殊的抗原和抗体,如果可以在早期诊断出癌变细胞的存在,那么便多一分希望来挽救生命。例如,在乳腺癌患者的体内,血管内皮生长因子的表达与P53 蛋白的表达存在一定的关系,根据这一原理,Lee研究组以抗血管内皮生长因子作为识别敏感元件,分别将其固定在n 型和p 型硅纳米线场效应晶体管表面,而将血管内皮生长因子作为待检测物质,制备了具有高检测灵敏度的硅纳米线生物传感器,得到了检测灵敏度分别为1.04 nM (图2(a))和104 pM(图2(b))的硅纳米线实时检测生物传感器。



图2 硅纳米线场效应晶体管对血管内皮生长因子的实时检测(a) n 型;(b) p 型


为了实现硅纳米线场效应晶体管对多种被测物质同时检测、提高检测效率的目的,可以通过对硅纳米线电子器件多个并列排布的检测沟道进行不同的功能化修饰,制备多功能化的硅纳米线场效应晶体管生物传感器。例如,Zheng 等将硅纳米线传感器用不同抗体修饰后实现对不同癌症蛋白标记物的高选择性和高灵敏度(费米浓度级别)电子检测,其器件结构如图2所示。图2下图中,黑色的横线代表硅纳米线,浅灰色部分代表金属电极。图3描述了针对前列腺异性抗原、癌胚抗原以及粘蛋白-1 的检测,分别采用相应的单克隆抗体对器件的硅纳米线进行相应的功能化修饰,从而实现对三种癌症标记蛋白同时检测目的的示意图,检测结果表明,不同的硅纳米线分别能够对相应的被测物产生相应的电导率变化,从而验证了硅纳米线生物传感器阵列能够同时实现多目标检测的优势。为了确定硅纳米线生物传感器件可以作为癌症诊断工具,研究者还成功地实现了对癌细胞中端粒酶活性的检测。



图3 纳米线器件阵列光学图和示意图


通常,为了尽可能提高生物传感器的检测性能,研究者还将多种检测技术结合起来,以期达到最佳的检测结果。而微流控技术与场效应晶体管结合是实现检测样品的预分离、减少进样量、加快分析速度、提高生物分子检测过程中的在线控制和自动化过程的一种最佳选择。例如,Wang 等将半导体检测技术和微流控技术相结合并用于识别生物体内能够抑制腺苷三磷酸(ATP)与酪氨酸激酶结合的小分子抑制剂。检测过程中,采用酪氨酸激酶功能化修饰的硅纳米线作为微流控沟道,随着ATP 浓度的升高,器件的电导值会逐渐变大;相反,没有经过功能化修饰的硅纳米线电子器件无论ATP 的含量多高,其电导率依旧保持一致,说明ATP 与酪氨酸激酶之间的结合能够显著增加电导。然而,当功能化电子器件中加入小分子抑制剂Gleevec/STI-571 时,随着小分子抑制剂浓度的增加,器件的电导率降低。这一现象充分说明了抑制剂能够成功地抑制ATP 与酪氨酸激酶之间的结合,从而达到抑制剂检测识别的目的。



图4 不同修饰物修饰的纳米线阵列的示意图


除蛋白质外,DNA 分子也是生物医学中常用的基因致病检测物质。DNA 传感器是一种能将目标DNA 的存在转变为可检测电信号的传感装置,它由两部分组成:一部分是识别元件,即DNA 探针或其他核酸探针;另一部分是换能器,在换能器上固定一条已知序列结构的DNA 探针,利用DNA 互补链能够杂化的特点,使探针DNA 与含有互补序列的被测DNA 分子进行杂化,杂化后通过电、光、声等的信号转换实现对目标DNA 的灵敏检测。囊性纤维变性是欧洲地区最致命的遗传疾病之一,而这种疾病主要是由于基因中缺失了三个碱基——CTT,从而导致第508 个密码子丢失而患病,CTT 碱基的存在或遗失是确定该疾病的一个重要依据。2004 年,Hahm 和Lieber将肽核酸功能化的p 型硅纳米线场效应晶体管与微流控技术相结合,期望硅纳米线电子器件能够从囊性纤维跨膜蛋白基因中分辨出突变碱基。当加入60fM 未突变DNA 序列时,器件电导值会因p 型硅纳米线与带有负电荷的DNA序列结合时产生的静电效应而迅速增加;而对于突变的DNA 序列,电导值也表现出增大的趋势,但增加比例远滞后于未突变的DNA 引起的电导率的变化,从而达到区分突变DNA 分子链的目的。此外,研究者还利用不同生物分子与硅纳米线表面的基团相互作用,对硅纳米线表面进行功能化修饰后研究了其对DNA 的电子识别性能。例如,Gao 等用n 型硅纳米线制备出非标记性的DNA 生物传感器阵列,通过与硅纳米线表面的羰基结合功能化修饰后,根据DNA 分子的杂交对硅纳米线表面的电荷密度变化而引起电学性质发生变化实现对DNA 的检测,其检测极限可以达到10fM。


硅纳米线场效应晶体管传感器在生物分子检测领域中还有许多其他的应用。例如,肌肉收缩、蛋白质分泌以及细胞生长和死亡等生命活动均与生物体内的金属离子(Ca2+、Na+等) 的浓度有关。因此,以Cui 等为代表的研究者又成功地利用功能化的硅纳米线传感器实现对生物体内金属离子浓度的检测,从而实现了对细胞等生命活动过程的监测。


虽然硅纳米线场效应晶体管在生物分子检测领域有很高的检测灵敏度和响应速度,但是由于硅纳米线尺寸小、制备过程复杂、表面容易被氧化、器件加工困难且其电子迁移率低,难以实现产业化,且硅纳米线电子器件在生物分子检测过程中需要对硅表面进行功能化修饰,大大增加了检测的复杂程度。所以,开发高性能、制备过程简单的新材料场效应晶体管生物传感器一直是人们的研究目标。


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基于氧化锌纳米棒的半导体生物传感器


氧化锌是一种宽禁带Ⅱ-Ⅵ族半导体材料,原子间主要以极性共价键结合,其场效应晶体管的电子迁移率要比传统的硅基半导体高一个数量级,且在室温下可以通过磁控溅射大面积均匀成膜,是构建大尺寸、柔性场效应晶体管的理想材料。利用氧化锌特有的电学性能和生物相容性好的特点,研究者构建了一系列不同结构的一维氧化锌纳米棒场效应晶体管,并根据生物分子对器件电性能的影响研究了其在纳米电子生物传感领域的应用性能。例如,Zhang 等利用化学气相沉积(chemicalvapordeposition,CVD)的方法合成的高质量一维氧化锌纳米棒构建了氧化锌场效应晶体管,表面经氨基功能化修饰后,通过尿酸与氧反应释放出的过氧化氢对晶体管电学性能的影响实现了对尿酸的高灵敏检测,其检测极限达到1pM,检测响应时间为14.7ns。为了提高氧化锌场效应晶体管的电子识别灵敏度,研究者进行了一系列的探索,除了对氧化锌材料本身进行掺杂改性外,对器件结构进行改进是一种可行路径。例如,Yeh 等设计了一种非对称的肖特基键接(分别采用Pt 和Pt-Ga 作为电极)制备了氧化锌纳米棒电子器件,其对生物分子的检测灵敏度和响应速度明显增加,对带负电分子的检测极限可以达到2fg/mL,为设计更具有实际应用价值的氧化锌生物传感器指明了研究的方向。为了解决氧化锌电子器件本身存在的漏电问题对检测灵敏度所造成的影响,在电子束光刻技术制备氧化锌纳米棒场效应晶体管的基础上,Kim 等对氧化锌纳米棒场效应晶体管的结构进行了改良,将晶体管的源极和漏极包埋在2.0μm 厚的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmecrylate,PMMA)中,明显降低了器件的漏电电流,提高了器件的稳定性和检测灵敏度,实验也证明其对链霉抗生物素的检测灵敏度大大提高。


值得注意的是,氧化锌纳米棒也可以用来构建液体栅极的场效应晶体管生物传感器,达到对不同生物分子高灵敏检测的目的。例如,Hahn等以垂直定向排列的氧化锌纳米棒(图5(b))为活性中间层,磷酸盐缓冲溶液为液体栅极,构建了如图5(a)所示的氧化锌场效应晶体管,器件表面经胆固醇氧化酶修饰后成功实现了对胆固醇的高灵敏实时检测。同样,氧化锌场效应晶体管表面经不同功能化修饰后也可以实现对抗体、血清蛋白、pH 等的选择性电子识别。


图5 (a)液体栅极氧化锌场效应晶体管结构示意图;(b)垂直定向排列氧化锌纳米棒的扫描电子显微镜图


氧化锌纳米棒场效应晶体管生物传感器的研究还处于起步阶段,还有很多问题需要深入研究和探讨,在未来的发展过程中,其主要研究趋势大致可分为以下三个方面:①场效应晶体管中分子识别元件的固定;②选择合适的衬底材料;③高质量氧化锌基纳米棒的合成与高性能电子器件的制备。


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基于碳纳米管的半导体生物传感器


碳纳米管是一种由二维石墨烯卷曲形成的无缝一维管状结构,其管壁上的每个碳原子通过sp2 杂化及少量的sp3 杂化与周围的碳原子形成六边形同轴碳环结构。按照卷曲形成碳纳米管的石墨烯层数的不同,碳纳米管可以分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管两种类型,其直径一般为0.6~20nm,构成碳纳米管的层片之间的间距约为0.34nm。碳纳米管具有高的模量、高的强度和独特的电学性能;特别是单壁碳纳米管,是一种性能优异的半导体材料,凭借其独特的结构和性能,在纳米电子器件领域发挥着越来越重要的作用。


近几年来,科学家们利用碳纳米管生物相容性好、其电子器件的电性能对外界电场变化灵敏的特性研究了其在纳米电子生物传感领域的应用性能。例如,Besteman等首先利用单壁碳纳米管场效应晶体管实现了对葡萄糖的高灵敏检测,开辟了碳纳米管电子器件进行生物分子电子检测的先河。在实验中,首先用线性分子(1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester)作为连接物,将葡萄糖氧化酶连接在碳纳米管表面,尽管他们没有明确解释为什么葡萄糖分子加入后会引起电子器件的电导值增加,但是实验现象和结果证明半导体碳纳米管场效应晶体管能够实现对0.1M的葡萄糖溶液对器件电信号变化的检测。另外,研究还发现,固定葡萄糖氧化酶的碳纳米管电子器件能够对不同pH 溶液发生可逆响应,并认为在pH 高的被测溶液中,葡萄糖氧化酶中带电基团会降低静电场效应,从而使碳纳米管场效应晶体管的电导率增加。


和硅纳米线场效应晶体管生物传感器相同,碳纳米管场效应晶体管也可以应用于各种生物分子(如蛋白质分子、DNA、核苷酸等)的电子识别。例如,Star 等用化学气相沉积生长的单壁碳纳米管构建的场效应晶体管实现了对蛋白质的高灵敏实时检测。不同的是他们先采用聚乙烯亚胺/聚乙烯醇(PEI/PEG)对碳纳米管表面进行覆盖,然后将生物素通过氨基固定在碳纳米管的表面作为链霉亲和素的受体。实验证明,聚合物覆膜可以隔绝链霉亲和素之间的相互作用,使之仅能通过特异性反应与生物素分子相连接,从而避免了链霉亲和素分子直接与碳纳米管表面接触而改变器件的电学性质,有效地保证纳米电子识别的准确性和选择性。Kojima研究小组也对碳纳米管场效应晶体管检测猪血清白蛋白的研究结果进行了有关的报道。实验中,采用物理吸附的方法直接将猪血清白蛋白抗体组装在碳纳米管的表面实现对猪血清蛋白的检测,器件的检测极限可以达到2.06μM。


在纳米电子识别过程中,DNA 检测时常用PNA 作为受体连接在半导体材料表面,导致检测过程复杂、灵敏度低。利用碳纳米管表面易于功能化修饰的特点,So等采用一种寡聚物替代肽核酸组装在碳纳米管表面,构建了一种用于凝血酶检测的纳米电子生物传感器。寡聚物是一种人工合成的寡核酸,能够与一些金属离子、小分子有机物、蛋白质及细胞等发生选择性结合,表现出和抗体物质相仿甚至更优越的特性。实验中选用的是凝血酶寡核酸5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3', 并在3'端用—NH2 进行功能化修饰,以方便其与连接分子CDI-Tween(carbodiimidazole-activatedTween 20)相结合。实验证明,功能化修饰的碳纳米管场效应晶体管生物传感器对凝血酶的检测浓度最低可达10nM,而且进一步的研究推测,如果使用更高质量的非金属性碳纳米管构建高性能的场效应晶体管电子器件,其检测极限有望达到纳米级别甚至更低。此外,Kim课题组用1-pyrenebutanoicacid succinimidyl ester 作为接分子(linker),在固定抗体时掺入一定浓度的阻隔剂(PB: 1-pyrenbutanol)来改变固定配体之间的距离,通过优化半导体材料表面配体的密度提高碳纳米管传感器的检测灵敏度,从而实现了对1.0ng/mL 前列腺癌抗原PSA-ACT 的选择性检测(图6)。而同样针对前列腺癌的探究,Lerner 等则选取了骨桥蛋白(OPN)作为前列腺癌的标记物,通过重氮盐与碳纳米管连接,其最终的检测极限可以高达30fM。


图6 PSA-ACT 抗原碳纳米管生物传感器结构示意图


相对于硅纳米线场效应晶体管,碳纳米管与DNA 分子尺寸相近且两者之间存在很强相互作用,不需要对碳纳米管表面进行功能化修饰即可实现DNA 与碳纳米管的紧密结合,生物传感器的制备过程简单。利用该特性,美国的Star研究小组首先将探针DNA 链固定在碳纳米管电子器件表面,根据互补链DNA 在杂化过程中电子掺杂对器件电性能的影响来实现对DNA 分子的无标记电子识别,但在检测机理方面,Star等没有充分考虑电极两侧电极和键接对器件电性能的影响。对此,Tang等认为,DNA 分子杂化之所以能够引起碳纳米管场效应晶体管电学性质的改变,其主要原因要归结于DNA 杂交对金电极和纳米管键接之间的肖特基势垒的调制。在这个过程中,单壁碳纳米管主要扮演着相互转换器的作用,对金电极表面的DNA杂交进行翻译和信号放大,转换成可检测的电学信号。在此基础上,Dong 等采用双壁碳纳米管构建的场效应晶体管研究了其对DNA 的电子识别机理,结果表明:在器件的电流开关比较小时,DNA 对碳纳米管与碳纳米管键接电性能的影响是决定器件检测灵敏度的关键。为了进一步提高碳纳米管场效应晶体管对DNA 的检测灵敏度和检测极限,Dong 等采用化学气相沉积合成的单壁碳纳米管构建了高电流开关比的场效应晶体管,将目标DNA 通过部分碱基配对固定在连有记录DNA 的金纳米粒子表面(图7),利用金纳米粒子的信号放大作用大大提高了碳纳米管场效应晶体管对DNA 的电子识别灵敏度,其识别物质的量浓度极限可以达到费米级浓度(100fM),并对其识别机理进行了相应的研究和探讨,认为DNA 分子对碳纳米管-金属电极键接的电子掺杂效应是实现DNA 无标记、高灵敏电子识别的关键。该研究进一步证明了碳纳米管场效应晶体管在超高灵敏纳米电子生物传感领域的应用前景。


图7 金纳米粒子存在下对DNA 高灵敏电子识别过程和识别机理示意图


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基于石墨烯的半导体生物传感器


石墨烯,是一种由单层碳原子按照sp2 杂化轨道紧密堆积而成的蜂窝状二维原子晶体(大π 共轭体系),2004 年由英国曼彻斯特大学的Geim 和Novoselov 利用机械剥落的方法从天然石墨中剥离出来,证实石墨烯可以在自然环境下稳定存在,两人也因其在二维石墨烯研究领域的开创性实验共同获得了2010 年的诺贝尔物理学奖。在电子结构上,石墨烯与碳纳米管具有密切的关联——单壁碳纳米管可以看成是由石墨烯卷曲而成的一维同轴圆筒。在石墨中,面内的每个碳原子都是通过sp2 杂化与相邻碳原子形成稳定的共价键,而在石墨烯的面外还存在一个由pz 轨道电子形成的离域π 键,二维石墨烯晶体的原胞结构如图8所示。图9 为通过紧束缚模型计算得到的石墨烯能带结构,此时费米面(EO)位于布里渊区中的K 和K'点上。


图8 石墨烯的二维晶体结构及其布里渊区


图9 紧束缚模型计算得到的石墨烯能带结构


由于石墨烯中的碳原子均为sp2 杂化,而多余的一个p 轨道电子形成一个可以自由移动的大π 键,其中的π 电子可以自由移动,所以石墨烯具有非常优异的导电性能,其电子迁移率在常温下可以达到~200000 cm2/(V·s),是目前商用硅片迁移率的十倍以上,且不受温度的影响,这也是石墨烯可以作为纳米电子器件半导体材料的最突出优势。石墨烯还具有优异的光学性能,其透光率能达97.7%;同时,石墨烯的强度和硬度也是目前已知材料中最高的。此外,石墨烯是一种能带带隙可调的二维纳米材料,使得石墨烯特别适合制备高性能的纳米场效应晶体管;而石墨烯比表面积大、生物相容性好的特点决定了石墨烯基场效应晶体管在纳米电子生物传感领域的广泛应用前景。


基于石墨烯场效应晶体管的电导率对外界电场环境变化非常敏感的特性,Schedim 等利用微机械剥离石墨烯构建的场效应晶体管首先实现了对单分子气体的超灵敏电子识别,从而激发了人们对石墨烯电子器件在传感领域的研究热情。在石墨烯场效应晶体管对气体分子检测研究的基础上,Mohanty 等构建了第一个真正意义上的石墨烯场效应晶体管生物传感器,并将其应用于DNA 分子和细菌的检测。他们首先采用还原的氧化石墨烯为半导体材料制备了p 型石墨烯基场效应晶体管,然后将单链DNA 分子组装到石墨烯表面,通过单链DNA 与荧光分子功能化修饰的互补链DNA 杂化,根据互补链DNA 杂化过程中所产生的电场效应对场效应晶体管电流的变化实现对互补链DNA 的电子识别,并用荧光检测技术进行了验证;同时,根据石墨烯电子器件表面吸附细菌后电流的变化还实现了对单个细菌的电子识别。随后,Dong 等利用化学气相沉积合成的大尺寸石墨烯构建了场效应晶体管并研究了其对DNA 的电子识别性能,根据被检测DNA 杂化过程中的电子掺杂效应对晶体管狄拉克点位移的影响实现了其对单链互补DNA 的高灵敏电子识别,其对单链DNA 检测范围在0.01~10nM;石墨烯表面经金纳米粒子的功能化修饰之后,检测上限可以达到500nM。但在检测机理方面,Dong 等提出了一个与Berry 等不同的机理,他们认为DNA 电子掺杂是影响石墨烯场效应晶体管电性能的主要原因,而不是Berry 等提出的静电场效应,并对此进行了相应的实验验证。


同样,利用抗体和抗原的特异性结合所引起的信号变化也可以实现非标记型蛋白质分子检测。例如,Ohno 等采用微机械剥离石墨烯构建的场效应管构建了高灵敏的牛血清蛋白生物传感器;随后,他们又采用免疫球蛋白E 的适配体作为识别分子,并将其固定在石墨烯表面,当抗原和免疫球蛋白结合时,通过器件电流的变化达到生物分子电子识别的目的,最终器件的检测极限可以达到47nM。为了进一步提高石墨烯场效应晶体管对蛋白质分子的电子检测灵敏度,Mao 等用金纳米粒子对热还原的氧化石墨烯进行功能化修饰后构建了新的石墨烯基场效应晶体管,并将免疫球蛋白的抗体组装在金纳米粒子表面作为分子识别元件,当免疫球蛋白与抗体相互作用吸附在金纳米粒子表面时,免疫球蛋白的负电荷所产生的场效应会使器件的电导率明显增加,从而达到对免疫球蛋白的选择性电子识别,检测极限可达到~13pM。


根据大多数生物分子的检测需要在溶液中进行的特点,Dong 等采用化学气相沉积合成的石墨烯构建了以磷酸盐缓冲溶液(PBS 溶液)为栅极的石墨烯场效应晶体管,利用石墨烯与芳香化合物之间存在很强的π-π 相互作用的特点,以末端带有芳香基团的功能性化合物为连接体对石墨烯进行功能化修饰后,分别实现了对葡萄糖和谷氨酸的选择性高灵敏电子识别(图10(a)),为未来开发具有实际应用特性的液体栅极场效应晶体管生物传感器奠定了基础。利用柔性石墨烯可弯曲、伸缩的特性,Kwak 等将石墨烯转移到柔性的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基板,构建了柔性石墨烯基半导体生物传感器(图10(b)),对其表面用葡萄糖氧化酶修饰后得到检测范围3.3~10.9mM 的葡萄糖生物传感器,该生物传感器即使在变形的情况下仍然能够给出准确的检测结果。尽管柔性石墨烯基场效应晶体管生物传感器在检测灵敏度方面没有达到高灵敏度要求,但我们相信凭借它柔性可变形、便携、耐磨、可植入的特点,在未来的生物传感器领域将具有非常广阔的应用前景。



图10(a)石墨烯基液体栅极葡萄糖生物传感器;(b)柔性石墨烯基葡萄糖生物传感器


石墨烯基场效应晶体管生物传感器除了能够实现对生物分子的实时检测,利用其比表面积大、与生物分子相容性好的特点还可以实现对活性细胞电势变化及细胞分泌物的实时检测。例如,Lieber 等将鸡的胚胎心肌细胞整合到石墨烯场效应晶体管表面研究了细胞的电势变化,结果发现晶体管的电导率信号可以有效地记录细胞受刺激时所产生的细胞外信号,信噪比大于4,其检测的灵敏度远超过硅纳米线和碳纳米管电子器件(图11)。He 等用化学还原氧化石墨烯搭建了一个活性通道达20.8μm × 9.8 μm 的石墨烯基场效应晶体管,并用于检测大鼠肾上腺骨髓神经内分泌细胞P12 在高钾离子刺激下的荷尔蒙儿茶酚的分泌情况,实现了石墨烯场效应晶体管对活性细胞分泌儿茶酚的无标记电子检测。此外,石墨烯基场效应晶体管还可以用来实现对活性细胞变化过程的实时检测,达到对细胞生长过程的监控。例如,被疟原虫感染的红细胞在不同的侵染阶段其结构和生理会发生相应的改变,如滋养体时期,感染的红细胞在外观上主要表现为细胞膜出现带正电荷旋钮状突起,细胞逐渐由软变硬,相应的寄生物蛋白开始表达;到了裂殖体时期,红细胞进一步变化,突起增大,正电荷增加,细胞硬度增强,寄生蛋白表达增加。根据这些变化,Ang 等制备了阵列式石墨烯场效应晶体管,结合微流控技术成功构建了流式石墨烯生物传感器,将受体蛋白CD-36 组装到石墨烯表面,用于捕获受到侵染的红细胞。根据不同感染时期的红细胞表面所带正电荷的数量的差异和细胞的软硬程度的不同导致的器件电导率和流过晶体管检测区域时间的不同识别出疟原虫感染红细胞后细胞受到侵染的程度,得到一个准确的疾病状态的微观信息。



图11 石墨烯场效应晶体管对活性细胞生物电的电子识别


但是,石墨烯能带带隙为零的半金属特性限制了其场效应晶体管性能的提高,通过结构改变来增加其能带带隙是一种最为有效的方法。例如,当石墨烯以纳米带结构存在时,其能带带隙可以被显著提高而呈现出半导体的特性,从而提高其场效应晶体管性能,为开发高灵敏纳米电子生物传感器提供了一种新的有效方法。研究表明,当能量不同的生物分子与石墨烯纳米带之间通过π-π 相互作用而吸附在其表面时,石墨烯纳米带电子器件的电导率会灵敏地对其做出不同的响应。Kim 等通过理论计算证明,当DNA 序列通过石墨烯纳米带电子器件的纳米通道时,器件电性能的变化可以准确区分DNA 中四种类型不同的核苷酸,而且这种识别性能远高于碳纳米管电子器件。在实际研究中,Dong 等采用化学剪切多壁碳纳米管得到的高质量的石墨烯纳米带构建的液体栅极石墨烯纳米带网络电子器件实现了对腺苷三磷酸的高灵敏和快速响应的电子识别,其检测极限比碳纳米管电子器件检测灵敏度提高一个数量级。


凭借超高的电子迁移率、超大的比表面积和良好的生物相容性等优点,石墨烯场效应晶体管在纳米电子生物传感领域表现出众多优势,也吸引着大批研究学者加入石墨烯生物传感领域中探讨研究,而随着石墨烯研究的深入,尤其是对其能带调控的精准性越来越高,其广阔的应用前景也将不断地呈现出来。


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其他材料半导体生物传感器


除了上述硅纳米线、氧化锌纳米棒、碳纳米管和石墨烯等半导体生物传感器外,金刚石、导电聚合物、无机非金属氧化物、二硫化钼等半导体场效应晶体管也被广泛应用于生物分子电子识别领域。例如,Kawarada 等采用金刚石构建的液体栅极场效应晶体管表面经RNA 核酸适体功能化修饰后成功实现了对蛋白质HIV-1 的电子检测。Nener 等利用AlGaN/GaN 的半导体特性制备了一种高活性的场效应晶体管生物传感器,将活性细胞直接整合在器件裸露的栅极表面,环境条件变化对器件电性能的影响研究表明,该电子器件对离子浓度变化有很高的响应活性。导电聚合物场效应晶体管生物传感器是最近几年发展起来的一类新的传感技术,由于导电聚合物具有结构可调、易于加工、柔性等特点,其器件在生物传感领域得到广泛的关注。例如,Jang 等以共轭结构的羧基化聚吡咯纳米管为活性导电层,表面羟基化处理的玻璃为衬底,构建了导电聚合物场效应晶体管,与之前的场效应晶体管对生物分子的检测机理相似,该导电聚合物场效应晶体管的电性能对外界电场变化非常灵敏,可以有效实现对血管内皮细胞生长因子的高灵敏实时检测,检测极限达到400fM,而且该器件具有很好的重复利用性。二硫化钼是一种厚度约为0.65nm 的新型二维材料,其构建的场效应晶体管对蛋白质的检测灵敏度可以达到100fM,是未来发展高性能生物传感器的一种可能材料。


综上所述,半导体生物传感器主要是根据半导体场效应晶体管的电性能对外来物种作用所产生的电导率变化来实现对不同生物分子的选择性电子识别。由于半导体场效应晶体管本身所具有的响应速度快、检测精度高、选择性好及无需荧光标记、检测成本低等特点,其在生物传感和临床检测领域得到人们的广泛关注。


在食品分析中的应用


食品安全是一个全球性的问题,随着人们生活质量的提高,对食品质量和安全性的要求也越来越高,长期以来广泛应用的物理、化学等分析方法已经不能满足现代食品检测的需要,特别是20 世纪80 年代以来,食品安全检测新方法、新技术不断涌现,对分析的灵敏度、特异性和快捷性提出了更加苛刻的要求。生物传感技术就是其中一种日渐成熟的食品安全分析技术,并广泛应用于食品工业中对食品质量的监测。


目前,我国在食品安全方面依然存在多种问题,比如农药残留、重金属超标、化学污染物、病原性微生物以及非法使用食品添加剂等,因此,加强对食品中的病原性微生物及毒素的检测至关重要,生物传感器可以实现对大多数食品基本成分的快速、准确检测。如大肠杆菌,对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼畜,常引起严重腹泻和败血症等,所以对食品大肠杆菌的检测对保障消费者安全显得尤为重要。常规的大肠杆菌检测方法周期长、过程繁琐,利用半导体场效应晶体管的电性能对外界电场变化非常灵敏的特性可以有效解决该问题。例如,Huang 等采用化学气相沉积合成石墨烯制备场效应晶体管,场效应晶体管表面经抗体修饰后实现对大肠杆菌的选择性电子识别,检测浓度大约为10cfu/mL;当大肠杆菌与场效应晶体管有效结合后,利用活性大肠杆菌与葡萄糖接触后能够进行新陈代谢并释放有机酸的特性,石墨烯基场效应晶体管还可以即时检测活性大肠杆菌的新陈代谢活动,这对分析大肠杆菌的传播特性和开展预防措施具有重要意义。


农药残留物的检测是人们日常生活中经常面临的另一个问题,传统农药分析方法设备昂贵、操作繁琐、周期长,而且不能实现现场应用,而场效应晶体管生物传感器在这方面显示出其独特的优点。例如,Starodub 等分别用丁酰胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶为敏感元件,制作了离子敏感型场效应晶体管生物传感器,实现了对有机磷类农药的快速测定。


在食品工业中,鱼和肉类鲜度的检测是评价食品质量的一个重要指标,通常采用的感官检测差异性大、主观性强、检测效果差。为了克服这一问题,VolPe 等以黄嗦吟氧化酶为生物敏感材料,结合过氧化氢电极,通过测定鱼降解过程中产生的一磷酸肌苷(IMP)、肌苷(HXR)和次黄嘌呤(HX)的浓度实现对鱼肉新鲜程度的定量评价。尽管半导体生物传感器的发展还没有完全展开,相信凭借其多功能、高质量、微型化的优点,半导体生物传感器在食品新鲜度检测方面必将会大有作为。


此外,半导体生物传感器在发酵工业中也发挥着重要的作用,尤其是微生物传感器,它可用于测量发酵工业中的糖蜜、乙酸等原材料和头孢霉素、谷氨酸、乳酸等代谢产物,甚至可以检测发酵液中的细胞数是否达到工业生产要求。


在环境监测中的应用


近年来,环境污染问题日益严重,如何实现对环境污染物的实时、快速检测是人们追求的目标,而生物传感技术恰恰是实现这一目标的最理想设备。目前,有相当多类型的生物传感器已经应用在环境监测中。


在水资源环境监测中,常用的污染指标有生化需氧量(BOD)、氨氮、亚硝酸盐、重金属离子、酚类化合物等。而BOD 是一种广泛采用的表征有机污染程度的综合性指标,常规的BOD 测定周期长、操作繁琐、重复性差,不适合对水资源的现场实时监测,而利用酵母、假单胞菌和芽孢杆菌等制作一种微生物BOD 传感器则可以快速稳定地达到检测目的,极大地简化检测程序。硝酸根离子也是一种主要的水源污染物,对人体健康危害极大,如何实现对硝酸根离子的快速、高灵敏检测也是监测水源污染的关键。在这一方面,Zayats 等将硝酸还原酶通过戊二醛连接在联吡啶修饰过的场效应管栅极表面,提出一种利用酶功能化装置检测硝酸根离子的方法,其对硝酸根离子的检测极限可以达到 7×10−5mol,响应时间低于50s,系统操作时间约为85s,并且可以在黑暗和光照条件下进行测量。在水溶液中重金属测量方面,Chen 等利用核酶在金属离子的调节下可自催化切割,切割后导致构象变化的特性,用核酶对石墨烯场效应晶体管进行表面修饰,在铅离子存在的条件下,核酶产生活性、对自身进行切割,由双链变成单链并引起晶体管狄拉克点的位移,从而达到对铅离子的选择性电子识别,其检测极限可以达到nM 浓度,相对于传统的铅离子光学传感器,该检测方法具有省时、省力、费用低廉、易于操作等特点。


生物传感器在大气环境监测中也扮演着非常重要的角色。以二氧化硫的检测为例,Martyr等将含亚硫酸盐氧化酶的肝微粒体固定在醋酸纤维膜上构建了一种新型生物传感器,微粒体在氧化亚硫酸盐的同时,氧电极周围的氧气也会被逐渐消耗,氧气的消耗导致溶解氧浓度降低并产生电流的变化,从而间接实现对二氧化硫浓度的准确检测。另外,在场效应晶体管栅极表面固定一定类型的微生物,根据微生物的状态变化可以实现对大气中CO2、NO2、NH3 等不同气体的实时监测。此外,如丙酮、甲醇、乙醇、二硝基苯等化学物质也可根据不同的检测机理制备相应的场效应晶体管生物传感器来进行电子识别。例如,在装修时总是会闻到一些刺鼻的味道,这种气体的主要成分就是甲醛,一种易挥发性的气体,当空气中甲醛浓度达到一定的程度时就会使人身安全受到威胁,所以需要在特殊环境中对甲醛进行监测。Korpan 等采用汉森酵母的醇氧化酶为分子识别元件实现对甲醛的识别,在给定的条件下传感器达到稳定响应只需要10~60s,对甲醛的检测浓度为10~300mmol/L。此外,生物传感技术在土壤环境监测、农药残留监测等领域的应用也越来越引起人们的高度重视。


生物传感器具有检测灵敏度高、快速、低成本、操作简单等特点,经过几十年的研究与发展,已经将生物传感技术与多种技术相交叉结合,在环境监测领域中也越来越得到人们的重视。相信在不久的未来,生物传感技术在临床研究、食品分析、环境监测等领域的发展趋势必将由单一功能向多功能发展,加速向微型化、智能化、集成化方向发展,并在相应的研究领域发挥更大的作用。


目前研究状况及展望


虽然生物光电子学中的生物传感技术的发展迄今仅约40 年的历史,但目前已经取得了诸多令人瞩目的成绩,特别是半导体生物传感技术在多学科交叉基础上向器件微型化、便携式、高灵敏、操作简单,甚至柔性化方向快速发展,已经出现了多种结构新颖、性能优异的生物传感器。但是,生物传感器在实际应用领域仍然面临着一系列的困难,在今后相当长的时间里,半导体生物传感器的研究将主要围绕以下几个方面开展:①开发高选择、抗干扰生物传感元件;②提高生物分子的检测稳定性;③提高信号检测器和信号转换器对信号的灵敏度;④开发新型半导体材料,提高器件本身性能;⑤将生物检测技术与材料、微电子、微加工等学科交叉,向多功能和智能化方向发展。在未来的发展过程中,除了扩大场效应晶体管生物传感器使用范围的研究外,在传感装置上仍需继续改进,设法解决目前所用大多数生物传感器只能在液相而不能在气相或固相状态下工作的局限。


本文摘编自黄维、董晓臣、汪联辉生物光电子学一书第三章部分,标题为编者所加


黄 维 董晓臣 汪联辉 著

ISBN 978-7-03-043327-5

责任编辑: 钱 俊


生物光电子学的研究内容主要包括三个方面:一是研究生物体系本身的电子学特性、生物体系中的信息存储和信息传递;二是利用光学材料和光学理论解决生物分子识别、信息传递、信息标记问题;三是应用电子信息科学的理论和技术解决生物信息获取、信息分析问题,发展生物医学检测技术及辅助治疗的新方法和新技术,探索开发微型检测仪器。围绕以上研究内容,本书系统、全面而又详细地介绍了生物光电子学的相关基本概念、基本理论及其在生物医学检测等方面的发展状况。基于对生物光电子学理论的理解,书中介绍了生物电子学、生物光子学及各种光电相关的生物传感器,讨论了相应生物传感器在实际电子器件中的应用。例如,场效应晶体管生物传感器、电化学生物传感器、表面等离子激元、微流控等。对于各种传感器件,本书主要强调了它们的基础知识、基本原理、结构和性能的关系等。


生物光电子学》可供生物、生物电子、光学、光电子学等相关领域的研究人员参考,也可供生物光电子学材料研发领域的科技人员使用。同时,作为一本系统介绍生物光电子学基本知识、基本理论的专业书籍,也可以作为各大院校相关专业师生基础知识读本。


(本期编辑:王芳)


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