在三年多攻博期间，除了上面提到的菌株转运方法的问题外，我也遇到过几次其他方法学上的难题。我每次都是将挑战作为建立新方法和发表论文的机会。

那时，我们实验室另有一个从事幽门螺杆菌免疫学方面的研究小组，其中有两位来自中国的学者，范学工（现中南大学湘雅医院副院长）和他妹妹范学军（现在美国做研究工作）。他们需要大量幽门螺杆菌细胞制备抗原，希望由我来提供，并告诉我他们老板答应给我劳务费。我当时大多数时间和精力都用在实验上，所以时间上应该没问题。尤其我的奖学金每年只有5000爱尔兰镑（当时约合60000人民币），一家三口全靠它。所以，我欣然接受了请求。但当时主要采用巧克力琼脂平板法培养幽门螺杆菌，液体培养技术并不成熟，所报道的仅限于小量（5-10 mL），而且培养48-72小时很容易引起污染。因此，难题在于当时还没有大批量培养幽门螺杆菌的方法。于是，在采用巧克力琼脂平板法培养并提供幽门螺杆菌细胞的时候，我同时考虑如何才能大量培养。我开始尝试在250-500 mL塑料培养瓶里培养。首先我根据文献开展预实验，在基本摸清和掌握了技术条件后，我正式设计并实施了实验方案，使这一技术得到验证和成熟。在积累经验的同时，还将成功培养出的幽门螺杆菌细胞“卖”给范氏兄妹。真是“功夫不负有心人！”这一液体培养方法的建立不仅给我带来了一篇方法学的论文，也是我成为大不列颠和爱尔兰病理学会成员的资本之一，更重要的是给我家庭带来更多的收入，使我不必像刚出国时到中国餐馆打工。这一研究结果发表在Journal of Clinical Pathology上：

Xia HX, English L, Keane CT, O'Morain CA. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid media. J Clin Pathol 1993;46 :750-3. (Cited by 34)

刚进实验室时，我延续同事采用的琼脂稀释法（Agar dilution method）做幽门螺杆菌对灭滴灵的药敏试验，并且定义最小抑菌浓度（MIC）大于8 µg/mL的分离株为对灭滴灵耐药。这种方法无疑是 “金标准”，但需要制备大量平皿，费时费力费钱，而且往往容易污染。能不能找到一种更简便又准确的幽门螺杆菌药敏试验方法呢？我做了全面的文献检索，的确没有！于是，我又向临床微生物的同事请教，了解到一种叫做纸片琼脂扩散试验（Disk diffusion test）的药敏试验方法已被广泛应用于临床检验。但与MIC 8 µg/mL相对应的抑菌圈半径（Diameter of the inhibitory zone）尚没有人报道。因此，我对121个临床分离株同时用琼脂稀释法和纸片琼脂扩散试验进行了药敏试验，分析了最小抑菌浓度和抑菌圈半径的关系，并确定与MIC 8 µg/mL相对应的抑菌圈半径为20 mm。与此同时，我在76位幽门螺杆菌感染阳性的消化性溃疡病或非溃疡性消化不良患者中进行了一项临床试验，发现经由纸片扩散试验确定感染敏感菌的病人经三联抗菌治疗其幽门螺杆菌感染的根除率为91.2%，而感染耐药菌的病人其根除率仅52.6%。这一结果发表在Antimicrobial Agents and Chemotherapy上：

Xia HX, Keane CT, Beattie S, O’Morain CA. Standardization of disc diffusion test and its clinical significance for susceptibility testing of metronidazole against Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 2357-2361. (Cited by 89)

这一方法的建立简化了药敏试验的方法，不仅为我今后的实验节约了大量时间，更为同行提供了切实可行的微生物学方法和标准。

快速尿素酶试验（Rapid urease test）是诊断幽门螺杆菌感染的经典方法，在相关领域几乎人人皆知，其中在国外风靡一时的CLO-test（Campylobacter-like organism test）的发明时间甚至比幽门螺杆菌的正式命名还早。幽门螺杆菌具有一个特点，那就是它可产生大量的尿素酶，能将尿素水解为二氧化碳（CO₂）和氨（NH₃）。快速尿素酶试验正是利用这一生化特点，在含有尿素和酚红的培养基或试剂里加入胃活检标本，如有幽门螺杆菌感染，幽门螺杆菌的尿素酶会作用产生二氧化碳和氨，前者进入血液，后者则可提高pH值，使培养基或试剂呈现粉红色。快速尿素酶试验由于其试剂配制简便、易于操作、且出结果快（可以在30分钟内出结果）而被广泛应用于临床。但其是否可以在所有情况下准确诊断幽门螺杆菌感染呢？比如，在病人服用抗生素的情况下，胃内幽门螺杆菌可能会受到抑制，细菌量会减少，有没有可能当细菌量减少到一定数量时，在快速尿素酶试验中其尿素酶不足以产生阳性反应（粉红色）呢？也就是胃活检标本最少需要多少幽门螺杆菌量才能在30分钟内产生阳性结果呢？为了回答这个问题，我首先比较了几种常见产尿素酶细菌的尿素酶活性，然后确定常规尿素琼脂斜面法和CLO-test产生阳性所需的最少细菌数。结果显示，在室温下最少需要106个幽门螺杆菌才可以在30分钟内产生阳性（几乎所有未经抗生素治疗的患者的活检标本都能够达到）。另外，如要在2小时内产生阳性反应最少需要103个细菌数。延长观察时间到24小时也不会再减少所需产生阳性结果的细菌数。这个结果说明在接受抗生素治疗的患者中，如果胃活检标本中细菌数达到不到这个数，那么快速尿素酶试验将呈假阴性。同时，其他产尿素酶细菌如克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）和奇异变形菌（Proteus mirabilis）在30分钟内没有阳性反应。奇异变形菌需要107个细菌数才可以在2小时内产生阳性反应。但延长观察时间到24小时，这两种细菌分别只需要<10和103个细菌就可以产生阳性反应。所以，快速尿素酶试验重在快速二字，且最好仅用作未经抗生素治疗患者的诊断。这项研究的结果发表在Journal of Medical Microbiology上：

Xia HX, Keane CT, O'Morain CA. Pre-formed urease activity of Helicobacter pylori as determined by a viable cell count technique--clinical implications. J Med Microbiol 1994;40:435-9. (Cited by 30)

其实，我还有其他改进实验方法的例子。这些改进不仅使课题顺利完成，写在论文里还可以大大提高论文质量。上述例子说明，在实验中遇到方法难题时，我们应该勇敢面对，想法设法去解决。除了克服和解决实验中遇到的方法难题外，我们还应对正在使用的方法原理和临床运用有深刻的认识，而不是“人云亦云”， “知其然不知其所以然”。这样，只要肯动脑筋，肯花时间，我们一定能收获许多“副产品”。这些“副产品”对于自己的学术生涯亦将起着不可忽视的作用！所以，“别拿豆包不当干粮！”

本文作者：夏华向 

实验“做得好”，未必“看着好”——如何获取高质量的素材？

如果您需要降低文稿重复率，或者有进一步的润色需求，您可以将您的文稿上传到美捷登投稿系统（电脑端）：http://online.medjaden.com/control/login

往期精彩回顾