基因组编辑技术将在生猪健康养殖中扮演重要角色
生猪养殖业是我国畜牧业中的主导产业，我国国民猪肉消费比例约占全国肉类总消费量的60%以上。随着农业现代化进程的加快，生猪养殖方式已由传统的农户小规模饲养转变为规模化以及超大规模化养殖，养殖方式的转变极大地适应了我国经济快速发展的需要。虽然规模化养殖可以促进经济发展，然而相伴而来的是生猪的健康问题，在我国生猪集约化生产过程中传染性病暴发流行对生猪养殖业造成的经济损失高达35-50%，疫病的发生往往导致猪肉价格走高，影响居民生活水平和国民经济稳定。近年来暴发的蓝耳病是危害全球生猪养殖业的一种烈性传染病。患蓝耳病猪只体温会升高至41℃以上；出现精神食欲下降，眼结膜炎，咳嗽，喘等呼吸道症状；可造成1月龄仔猪死亡率达80%以上，育肥猪死亡率达40%以上。该病的致病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），简称蓝耳病毒，具有变异快和感染特征复杂等特性，且其致病机制和免疫机理尚未被完全阐明，所以至今仍未研制出长期有效的防控疫苗和完全有效的防控策略，是威胁全球生猪健康养殖的头号烈性传染病，单在北美，每年可对生猪养殖业造成高达6亿美元的经济损失，在欧洲，对生猪养殖业所造成的经济损失更是高达15亿欧元[1]，对我国生猪养殖业所造成的损失目前尚无一个准确的统计数据，2006年夏季在我国暴发的一种变异型的高致病性蓝耳病病毒造成超过200万头生猪的死亡，此后周期性的暴发已对我国生猪养殖业造成难以估量的损失。对于困扰全世界生猪健康养殖长达25年之久的蓝耳病，难道我们真的是束手无策吗？当然不是，随着基因组编辑技术的出现，人类完全有可能应用这项当今最前沿的现代生物技术来扭转目前的被动局面。
基因组编辑技术是指利用识别基因组上一段特定序列的人工核酸酶对细胞中的DNA进行进切割，使其产生双链断裂，随后借助细胞的DNA修复机制来实现基因组特定位点上DNA碱基的删除、添加或替换，以及外源DNA的插入等操作的一种基因工程技术（图1）。高效精确的基因组编辑技术对于基因功能的研究、家畜的遗传改良和人类疾病动物模型的构建等研究具有强大的推动作用，如今已发展成为最前沿的现代生物之技术之一。目前用于基因组编辑的特异性人工核酸酶主要有锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）、转录激活子样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effector, TALEN）和成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR）/Cas9 （CRISPR associated protein 9）。其中2012年横空出世的CRISPR/Cas9技术是一种由短片段RNA引导Cas9核酸酶在基因组中进行精确的靶向切割的方法，相比ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9技术更加简单、高效和经济，在问世的3年多里已连续3次入选Science杂志年度十大突破，其中2015年更是被评为头号突破。
图1.CRISPR /Cas9介导的多种基因组编辑方式
与艾滋病病毒非常相似的是，蓝耳病病毒也是一种RNA病毒，它也是通过攻击免疫系统，即通过感染猪的一种免疫细胞―肺泡巨噬细胞使猪得病。科学家在研究艾滋病病毒时发现世界上有少数人具有天然的抵抗艾滋病病毒感染的能力，通过深入研究后，科学家发现原来这些幸运者体内的一个病毒的关键受体基因-CCR5基因编码区域第185号氨基酸后面发生32个碱基的缺失，称之为CCR5△32突变，就会在细胞膜表面产生截短的、无功能的穿膜蛋白质，使嗜巨噬细胞艾滋病病毒不能进入人体细胞，发展为艾滋病。类似的，如果能够对蓝耳病病毒入侵猪肺泡巨噬细胞所需的关键受体基因进行精确的缺失突变，也是很有可能培育出具有天然的抵抗蓝耳病病毒的新品种猪。多年来的研究推测猪肺泡巨噬细胞表面上可能存在多个与感染蓝耳病病毒相关的受体，其中唾液酸粘附素（SIGLEC1基因表达产物）和CD163蛋白在病毒入侵过程中可能起到比较关键的介导作用（图2）[2]。
图2. 蓝耳病病毒感染猪肺泡巨噬细胞模式图（红色箭头示关键受体CD163蛋白）
2013年美国密苏里大学动物科学学院的Prather教授带领的研究团队通过传统的基因敲除技术获得了SIGLEC1基因敲除猪，满怀希望这些猪可以抵抗蓝耳病病毒的感染，然而令人失望的是，在攻毒实验中，这些基因敲除猪与普通猪一样，都会感染蓝耳病病毒纷纷倒下，产生一样的临床症状，因此推测SIGLEC1应该不是那种像CCR5对艾滋病病毒一样的至关重要的受体。Prather教授团队并没有因此而停止研究步伐，他进一步把目光聚焦到CD163身上，这次他们与全球最大的种猪改良公司PIC合作，应用最先进的基因组编辑技术CRISPR/Cas9对CD163基因进行精确的修饰，使其产生类似CCR5△32突变的定向缺失，无法表达出有功能的CD163受体，于2014年成功获得了一批CD163基因编辑大白猪（图3）[3]。
图3. CD163基因被CRISPR/Cas9精确编辑过的大白猪幼崽
激动人心的时刻到了，2015年Prather教授团队对这些基因编辑猪进行蓝耳病病毒攻毒实验[4]，看看这些猪能否抵御住病毒的攻击，结果令人欢欣鼓舞，研究人员发现与普通猪大不一样，在攻毒后，普通猪纷纷倒下，表现出典型的蓝耳病症状―呼吸困难和发高烧的临床特征时，而这些基因编辑猪却安然无恙，丝毫没有发病迹象（图4）。研究人员进一步对猪的肺脏进行组织病理学分析，结果更是令人感到无比兴奋，与普通猪肺部发生严重的水肿和炎症反应不同的是，基因编辑猪在攻毒后肺部完全没有水肿迹象和炎症反应，结构完好无缺（图5），表现出彻底的抵抗蓝耳病病毒感染的能力！应用基因组编辑技术，人类终于在对付威胁生猪健康养殖的头号疾病的研究中取得了突破性的进展。与传统转基因动物不同，这些基因编辑猪的基因组中仅仅是CD163基因产生精确的碱基缺失，并未导入任何外源DNA序列，基本上消除了传统转基因动物所面临的生物安全性风险，目前PIC公司正利用这些基因编辑猪作为育种新材料，致力于培育抗蓝耳病新品种猪，预计最快5年之后才能上市。
图4. 基因编辑猪在蓝耳病毒攻毒后无发病症状
图5. 基因编辑猪在蓝耳病毒攻毒后肺部无水肿和发炎症状
非洲猪瘟同样是一种威胁生猪养殖业的接触性烈性传染病，得病的猪死亡率超过67%。英国罗斯林研究所BruceWhitelaw教授领导的研究团队发现一个有趣的现象：非洲疣猪通常会携带非洲猪瘟病毒，却不发病，而家猪在感染非洲猪瘟病毒后，在很短的时间内就会发病倒下。他们在分析这种差异背后的原因时，发现原来与感染非洲猪瘟病毒相关的一个关键基因RELA在家猪和非洲疣猪中存在3个不同的单碱基突变（SNP），这可能是家猪易感猪瘟病毒的一个重要遗传差异。该研究团队在今年应用另一种基因组编辑技术-ZFN，通过同源重组机制，成功地将家猪RELA基因的3个SNP更改为非洲疣猪的SNP，也是非常有希望获得天然抵抗非洲猪瘟病毒的基因编辑猪[5]。
CD163基因编辑猪的问世无疑为生猪的健康养殖提供了一种全新的有效策略，在人类对威胁生猪健康的其他烈性传染病的致病机理都有比较深入的了解后，同样可以应用基因组编辑技术对生猪的基因组进行精确的遗传修饰，取得常规防控手段难以达到的效果，从而提高生猪的健康水平，使生猪生产更加稳健和高效，为我国人民的猪肉消费市场提供更可靠的保障。
参考文献
1. Neumann, E.J., et al., Assessment of the economic impact of porcine reproductive andrespiratory syndrome on swine production in the United States. J Am Vet MedAssoc, 2005. 227(3): p. 385-92.
2. Van Breedam, W., et al., Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus entry into the porcine macrophage. J Gen Virol, 2010. 91(Pt 7): p. 1659-67.
3. Whitworth, K.M., et al., Use of the CRISPR/Cas9 system to producegenetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos. BiolReprod, 2014. 91(3): p. 78.
4. Whitworth, K.M., et al., Gene-edited pigs are protected from porcinereproductive and respiratory syndrome virus. Nat Biotechnol, 2015.
5. Lillico, S.G., et al., Mammalian interspecies substitution ofimmune modulatory alleles by genome editing. Sci Rep, 2016. 6: p. 21645.
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