代谢学人

撰文 | 程诗淼 高铭远 生茂正 郭盈盈 于剑 

编辑 | 孟美瑶

校对 | 于剑

背景介绍

近年来，由于肥胖引起的2型糖尿病(T2D)的患病率日益升高，尽管目前市面上有多种抗糖药物，但仍有许多T2D患者存在胰岛素抵抗，无法将血糖控制在最佳水平。脂肪组织、肝脏和骨骼肌等关键代谢组织中促炎ATMs的浸润和积累引发的慢性炎症是导致胰岛素抵抗和T2D的重要因素，大多数促炎ATMs来源于循环单核细胞，而大多数抗炎ATMs来自胚胎发育期间的卵黄囊常驻细胞（小编注：抗炎巨噬细胞称为M2样巨噬细胞，促炎巨噬细胞称为M1样巨噬细胞（CAM）。抗炎巨噬细胞主要由瘦脂肪中的组织驻留巨噬细胞构成，由胚胎发育期间的卵黄囊随着生长发育分化而来，而促炎巨噬细胞主要存在于死亡或垂死的脂肪细胞周围的环状结构中，来自造血干细胞形成的外周单核细胞，M2巨噬细胞表达CD11b，F4/80，CD301和CD206，并产生抗炎细胞因子而M1巨噬细胞除了表达CD11b和F4/80外还表达CD11c，并分泌促炎细胞因子，包括TNF-α，IL-1β，IL-6等）。促炎ATMs类似于内毒素刺激后骨髓源性巨噬细胞(Bone-marrow-derived macrophages,BMDMs)的M1极化，而常驻抗炎ATMs类似于BMDMs的M2极化。

ATM主要来源于组织驻留巨噬细胞和单核细胞来源的募集巨噬细胞，具有调节组织重塑和维持组织稳态的功能。

在非肥胖条件下，ATM发挥抗炎作用，能够清除死亡的脂肪细胞，在维持脂肪组织稳态方面具有重要作用，同时ATM对米色脂肪生成和产热也至关重要。在冷刺激的响应下，ATM被激活并通过巨噬细胞分泌的细胞因子Slit3和交感神经元-脂肪细胞信号转导轴促进米色脂肪细胞的生物发生。抗炎ATM还能够被β3-AR诱导，刺激米色脂肪细胞发育，进而改善代谢。

而在肥胖状态下ATM的积累是导致肥胖引起的局部和全身炎症的关键因素，新募集的促炎ATM会释放大量促炎细胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-1β，并阻碍脂肪细胞中的胰岛素信号转导，降低脂肪细胞的胰岛素敏感性。而胰岛素抵抗的脂肪细胞释放更多的游离脂肪酸并激活ATM，导致恶性循环加剧炎症，对脂肪组织功能表现出不利影响。

参考文献：

[1]Li X et al. Front Immunol. 2023 Apr 19;14:1153915.

小细胞外囊泡（Small extracellular vesicles,sEVs)是细胞分泌的微小蛋白质膜囊泡，sEVs的主要类型包括外泌体、微泡和凋亡小体。sEVs能够携带货物包括蛋白质、脂质、microRNAs (miRNA)等通过细胞间(旁分泌)和器官间(内分泌)机制进行通信，从而在不同细胞或组织之间传递生物信号。

噻唑烷二酮(TZDs)是PPARγ激动剂类抗糖尿病药物，可诱导机体对胰岛素敏感性增加并降低血糖水平，然而TZDs的使用也会带来体重增加和血液稀释的副作用。近几十年来，许多科学家试图揭示TZD诱导胰岛素增敏的作用机制，提出了包括脂肪细胞分泌脂联素增加、小脂肪细胞增殖、细胞内甘油三酯从肌肉和肝脏重新分配到脂肪组织等多种机制，但有关TZD如何介导胰岛素敏感性的具体机制仍未被完全解析。为了解决这一问题，美国加州大学圣地亚哥分校的 Jerrold M. Olefsky团队进行相关研究，其成果“Adipose tissue macrophages secrete small extracellular vesicles that mediate rosiglitazone-induced insulin sensitization”近期发表在Nature Metabolism上，该研究发现Rosi-ATM-sEVs可在体内缓解肥胖引起的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗，促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌，Rosi-ATM-sEVs中的miR-690能够带来有益的代谢效果。

在细胞中，与类视黄醇X受体（RXR）形成异二聚体。TZD是PPARγ激动剂，当细胞受到TZD刺激时，异二聚体发生构象变化，从而促进了PPARγ-RXR复合物与靶基因中PPARγ反应元件（PPRE）的结合，而PPRE存在于编码脂蛋白脂肪酶、脂肪酸转运蛋白、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白、脂肪酰辅酶A合酶、苹果酸酶、葡萄糖激酶和GLUT4葡萄糖转运蛋白等许多参与脂质代谢和能量平衡的基因，从而上调了这些基因的表达水平，进而通过增加葡萄糖转运、脂质合成、脂肪酸代谢及胰岛素传递而增加机体胰岛素敏感性。此外还有研究发现TZD类药物能够上调白色脂肪组织中的脂联素和血浆脂联素水平，这降低循环血清甘油三酯和游离脂肪酸水平，并下调TNFα和抵抗素的产生和分泌。

参考文献：

敲黑板啦！

1、Rosi减轻HFD小鼠胰岛素抵抗和炎症，改变ATMs的转录组谱

2、Rosi-ATM-sEVs可以增强胰岛素敏感性，促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌

3、Rosi-ATM-sEVs的miRNAs产生有益的代谢效应

4、miR-690是Rosi-ATM-sEV代谢效应的关键因子

1、Rosi减轻HFD小鼠胰岛素抵抗和炎症

研究人员首先探究了Rosi在肥胖小鼠体内的作用。研究人员将野生型小鼠分为三组，其中两组小鼠分别进行NCD和HFD喂养16周，另一组小鼠在HFD喂养12周后，在饮食中添加Rosi(3 mg kg^-1d^-1)（以下简称为Rosi饮食）继续喂养4周，结果发现Rosi饮食小鼠体重显著高于HFD喂养小鼠(图1A)，然而Rosi饮食小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性得到改善，几乎接近NCD小鼠水平，同时具有较低的空腹血糖和胰岛素水平(图1B-D)，因此Rosi处理可显著改善糖代谢。

先前并没有文章报道Rosi饮食导致附睾脂肪组织巨噬细胞发生的主要表型变化。研究人员通过进一步研究发现，与HFD小鼠相比，Rosi饮食小鼠脂肪重量显著增加，特别是皮下脂肪(图S1A)，与此同时，Rosi处理导致基质血管细胞(Stromal vascular cells, SVCs)中的ATMs比例减少约20%，ATMs总数减少约60%(图1E、图S1B)，并且Rosi处理导致eWAT ATMs中具有较低水平的CD11c⁺CD206^low“M1样”ATMs和较高水平的CD11c^-CD206^high“M2样”ATMs(图1F)。此外，研究人员发现与HFD小鼠相比，Rosi处理能够导致脂质相关巨噬细胞(Lipid-associated-macrophages ,LAMs)，如CD9⁺LAMs和CD9⁺ Trem2⁺ LAMs在LAMs中的百分比和数量都有所降低(图1G、H)，同时Rosi处理小鼠的eWAT中CD11b⁺SiglecF⁺嗜酸性粒细胞水平显著上调(图S1C)。

接下来，研究人员分析了皮下脂肪组织ATMs，发现Rosi处理后皮下脂肪组织ATMs数量同样减少(图S1D)。并且SubQ中“M2样”ATMs在总ATMs中的占比高于eWAT(已达到约70%)(图S1E)，这可能是观察到CD11c⁺、CD9⁺、CD9⁺ Trem2⁺ LAMs等“M1样”ATMs的减少，而“M2样”ATMs并未增多的原因（小编注：即总ATMs降低，M1细胞数目降低，M2细胞数目没变。所以展现的结果为M2细胞的比例上调）(图S1E-G)。除此之外，在Rosi处理小鼠的SubQ中嗜酸性粒细胞的百分比也有所增加(图S1H)。

随后研究人员进一步研究发现Rosi通过上调PPARγ靶基因CD36和编码“M2样”巨噬细胞标记物CD206的甘露糖受体(Mannose Receptor C-Type 1,Mrc1)基因的表达（小编注：CD206，也称为甘露糖受体C型1，是一种膜结合蛋白，主要表达在巨噬细胞表面，特别在M2巨噬细胞中高表达，MRC1的胞外结构域能够识别多种内源性及外源性配体（如糖蛋白和糖脂）并将其吞噬进入细胞，在抗原呈递中发挥重要作用，因此是识别M2巨噬细胞最常用的标志物之一。半乳糖凝集素-1也是具有内吞功能的跨膜受体，其在胞外的结构域能够识别并结合末端N-乙酰半乳糖胺聚糖残基，此类残基常见于肿瘤细胞上的Tn抗原，因此半乳糖凝集素-1能够参与调节炎症和体内脂肪细胞的功能），或降低“M1样”标记基因Tnf、Il1b、干扰素γ(Interferon Gamma,Infg)的表达来促进抗炎ATM表型(图S2A、B)。与未经处理的M1-BMDMs相比，体外Rosi处理M1 BMDMs后M2标志物CD206(图S2C)、巨噬细胞半乳糖型凝集素-1(Macrophage Galactose-Type Lectin-1，Mgl1)、PPARγ及其靶基因Cd36的表达均有增加(图S2D)，而促炎细胞因子基因Infg和Il1b的表达降低。除此之外，研究人员还发现Rosi处理M2-BMDMs后，Trem2的表达水平上调，且CD206有明显的上升趋势(图S2E)。

研究人员对Rosi处理小鼠的肝巨噬细胞与NCD和HFD小鼠的肝巨噬细胞进行了比较(图S3)，发现与NCD小鼠相比，HFD小鼠中CD11b ⁺F4/80^+low募集肝巨噬细胞(Recruited Hepatic Macrophages ,RHMs)的百分比更高，而Rosi处理并未改变RHMs的比例(图S3A)。与NCD小鼠相比，HFD小鼠肝脏中CD11b⁺F4/80^high库普弗细胞(Kupffer cells ,KCs)的百分比降低，但总数量与NCD小鼠相似，因为HFD增加了分离的非实质细胞(Non-parenchymal cells,NPCs)的总数(图S3B)。此外，研究人员发现体内Rosi治疗导致KCs百分比和数量增多，其中包括了Clec4F⁺ KCs和Trem2⁺ KCs的增加(图S3B-D)，这些KCs促炎巨噬细胞标志物CD11c和CD9表达水平较低(图S3E、F)，这些结果与Rosi处理后脂肪组织的变化结果相似，即Rosi处理后肝脏中嗜酸性粒细胞含量升高(图S3G)。

总的来说，以上数据表明，Rosi处理降低了eWAT/SubQ ATMs的促炎特征，增加了肝脏KCs和嗜酸性粒细胞。

图1.罗格列酮提高肥胖小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，降低脂肪组织炎症

图S1.罗格列酮减少脂肪组织炎症，增加附睾(eWAT)和皮下脂肪(SubQ)中的嗜酸性粒细胞百分比

图S2.罗格列酮降低促炎细胞因子基因表达，增加PPARγ靶基因和抗炎基因表达

图S3.罗格列酮增加肝库普弗细胞和嗜酸性粒细胞

2、Rosi处理改变ATMs的转录组谱

为了确定Rosi处理后ATMs的转录组谱，研究人员从HFD小鼠和Rosi处理小鼠的eWAT中分离了SVCs进行单细胞RNA测序，通过聚类分析确定了T细胞、B细胞、树突状细胞、内皮细胞、肥大细胞、脂肪祖细胞和巨噬细胞等不同细胞类型(图2A、图S4A)。结果发现Rosi导致脂肪细胞祖细胞增多和ATMs减少(图2B)。并且在Rosi处理后，PPARγ靶基因如Cd36、脂肪酸结合蛋白4(Fatty Acid Binding Protein 4,Fabp4)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase 1,Pck1)以及其他参与PPAR信号传导的基因表达均被显著上调(图S4B)。

随后研究人员观察到与HFD组相比，Rosi处理后ATM转录组发生显著变化(图2C)。研究人员发现在Rosi处理后巨噬细胞簇中显著差异表达基因的数量最多，其次是前体脂肪细胞，而B细胞、T细胞和DCs无显著变化。GO分析显示，Rosi处理后巨噬细胞中上调的基因与细胞分化/迁移、胰岛素反应/信号传导、葡萄糖转运/稳态以及脂质稳态/储存等生物过程有关(图S4C)。而Rosi-ATMs中下调的基因与适应性和先天免疫途径、炎症反应、缺氧、LPS、干扰素γ和肿瘤坏死因子信号传导等生物过程相关(图S4D)。

接下来为了进一步探究ATM的异质性，研究人员对巨噬细胞进行了亚群分析，并确定了五个亚群(Mac1-Mac5)(图2D、图S4E)。与图1的流式细胞术数据一致，研究人员发现Rosi处理后单核细胞衍生的亚群Mac5和“M1样”ATMs亚群Mac3水平降低，而“M2样”ATMs亚群Mac4水平升高(图2E和图S5A)。并且研究人员发现在Rosi处理小鼠的“M1样”ATMs亚群Mac3中具有显著差异的DEGs和相关通路最多(图S5B)。除此之外，Rosi处理导致第二个“M2样”ATM亚群Mac1的百分比降低(图2E和图S5A)，该亚群表达较高水平的经典“M2样”巨噬细胞标记基因G蛋白偶联受体E1(Adhesion G protein-coupled receptor E1,Adgre1)、白细胞介素10(Interleukin 10,Il10)、MAF bZIP转录因子B(MAF bZIP transcription factor B,Mafb)、补体C1q结合蛋白(Complement C1q B Chain,C1q)、集落刺激因子1受体(Colony Stimulating Factor 1 Receptor,Csf1r)和载脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apoe)，而一些LAM特异性基因CD9、脂肪酸结合蛋白5(Fatty Acid Binding Protein 5,Fabp5)和髓系细胞触发受体2(Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells 2,Trem2)表达水平较低(图S4E)。接下来，作者通过拟时序分析确定细胞状态变化情况(图2F)，发现存在一条拟时序轨迹，且在该轨迹中Mac1细胞发生复极化并合并到主要的“M2样”ATM亚簇Mac4中（小编注：在本文中GO分析中，Mac1亚群细胞的cAMP合成、LDL代谢、活化蛋白激酶A等通路上调，树突状细胞负调控、趋化因子信号等下调；而Mac4亚群则是上调了mRNA切割、IL2信号、IL1β信号等通路，下调了包括低氧等通路。复极化则指已经极化的Mac1在Rosi刺激下重新极化，变为Mac4类群细胞）。此外，与囊泡出芽相关的胞吞、胞吐或囊泡运输途径，在Rosi-ATM尤其是Mac1-Mac4中显著上调(图S4c、图5c)。

综上所述，这些结果表明Rosi处理导致ATM转录组发生显著变化，包括促炎ATM亚群Mac5和Mac3亚群比例下降，以及主要的“M2样”ATM亚群Mac4比例增加。第二个“M2样”亚簇(Mac1)似乎已经复极化，并合并到Mac4亚簇中。

图2.Rosi处理改变了ATMs的转录组谱

图S4.间质血管细胞的聚类分析

图S5.Rosi处理改变了ATM亚群的转录组谱

3、Rosi-ATM-sEVs可以改善体内代谢平衡

Rosi高度依赖巨噬细胞来增加机体胰岛素敏感性，最近的研究表明ATMs可以释放胰岛素敏感型sEVs。因此基于图2中的数据，研究人员假设Rosi处理引起ATMs转录组改变从而赋予ATMs产生分泌胰岛素敏感型sEVs的能力。为了研究Rosi-ATM-sEVs的潜在代谢作用，研究人员从NCD、HFD和Rosi处理的HFD小鼠的CD11b⁺ F4/80⁺ATMs中分离出sEVs。在分离培养24小时后，ATMs的存活率大于90%，并且在培养前后巨噬细胞标志物的表达未发生变化(补充图1C-E)。外泌体特异性标志物ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X,Alix)、CD63、CD9和CD81以及外泌体相关蛋白标志物HSP90均在分离的ATM-sEVs中表达，而内质网蛋白(Glucose-regulated protein 94,Grp94)仅在细胞裂解物中表达(图S6A)（小编注：分离出的sEVs包含外泌体特异性标志物蛋白同时不包含胞内细胞器蛋白如内质网高尔基体，验证了分离出物质确实是sEVs同时不包含其他物质）。研究人员通过NanoSight分析，发现ATM-sEVs的平均尺寸为120-150nm(图S6B、C)。与HFD-ATMs分泌的sEVs相比，Rosi组小鼠的ATMs分泌出更多的sEVs，同时分泌出的sEVs直径也更小(图S6B)，这与先前发现的囊泡出芽等囊泡运输相关通路上调相一致（小编注：作者在前文发现在Rosi-ATM中与囊泡出芽相关的胞吞、胞吐或囊泡运输途径上调，与此处Rosi组小鼠的ATMs分泌sEVs数量增多相一致）。除此之外，研究人员还使用BMDMs作为巨噬细胞sEVs的体外来源，所得结果与体内数据一致(图S8B、C)，即Rosi处理BMDMs会产生更多较小sEVs(图S6D)。

为了探究Rosi-ATM-sEVs对体内葡萄糖代谢的影响，研究人员使用一组HFD肥胖小鼠进行实验，对小鼠进行HFD喂养10周后，开始分别使用Rosi-ATM-sEV，HFD-ATM-sEV，PBS脂质体处理或进行Rosi饮食。每只小鼠每次注射10⁹ sEVs，每周两次，持续一个月。结果发现所有sEV处理的小鼠体重相似，而Rosi饮食小鼠体重增加(图3A)。HFD-ATM-sEV处理小鼠空腹血糖水平最高，同时表现为严重的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗(图3B-D)。与PBS脂质体处理的HFD小鼠相比，Rosi-ATM-sEV处理的HFD小鼠空腹血糖和胰岛素水平降低，葡萄糖耐量和胰岛素敏感性有所改善(图3B-D)。

Rosi-ATM-sEV处理和Rosi饮食对小鼠的葡萄糖耐量具有相似的改善情况，使其接近于正常化(图3B)，虽然Rosi-ATM-sEV处理组小鼠具有非常显著的胰岛素敏感性改善和血清胰岛素水平降低效果，但仍不如Rosi饮食组小鼠效果明显。此外，与PBS脂质体处理的HFD对照组小鼠相比，HFD-ATM-sEV处理小鼠中胰岛素刺激的肝脏、肌肉和脂肪组织中的AKT磷酸化减少，但Rosi-ATM-sEV处理小鼠的磷酸化水平较高(图3E、图S7A)。

除此之外，研究人员发现与PBS脂质体对照组相比，Rosi饮食小鼠的脂肪组织PPARγ丝氨酸位点S273和S112（小编注：PPARγ S273位点磷酸化后会导致机体胰岛素敏感性降低，PPARγ S112位点磷酸化后会降低PPARγ活性）的磷酸化水平减少，总PPARγ水平上调，而Rosi-ATM-sEVs处理并未改变PPARγ的总表达或降低S273和S112的磷酸化水平，但HFD-ATM-sEV处理导致S273的磷酸化程度更高(图S7B)。与Rosi饮食处理组相似，Rosi-ATM-sEV处理组具有较高的血浆脂联素水平和较低的总胆固醇和甘油三酯水平(图3F)。

与此同时，Rosi-ATM-sEV处理也能够减少脂肪组织炎症，CD11c⁺或CD9⁺“M1样”ATMs以及CD9⁺ Trem2⁺ LAMs均有所减少，而“M2样”ATMs未发生变化(图S7C-E)。虽然Rosi饮食导致“M2样”ATMs的百分比增加，但Rosi饮食也显著降低了ATMs的总体数量，因此每克脂肪组织中CD11c^- cd206^highATMs的总数没有增加(图S7D)。研究人员还发现Rosi-ATM-sEVs处理不会带来体重增加或红细胞压积水平降低（小编注：红细胞压积即红细胞比容，是指全血离心后测得红细胞所占的百分比，红细胞压积水平低会导致贫血，该症状（轻度-中度贫血）也是罗格列酮等TZD的典型不良反应）的典型TZD副作用(图3A、G)。Rosi-ATM-sEVs和Rosi处理小鼠血浆中sEVs浓度相似。其中Rosi-ATM-sEVs剂量（10⁹）约为小鼠总血液sEVs的10%，Rosi-ATM-sEVs在很大程度上取代了HFD小鼠中Rosi诱导产生的sEVs，表明sEVs的剂量是生理性的，而非药理性的（小编注：此处作者意为药理条件下即109Rosi-ATM-sEVs注射剂量给小鼠带来的影响与生理条件下即HFD+Rosi喂养的小鼠带来的影响相似，因此该剂量并非属于药理性的高浓度刺激，而是可以由机体自我产生的生理性浓度，说明了该剂量的安全性）(图S7G）。

图3.来自Rosi处理的肥胖小鼠的ATM-sEVs能够改善体内的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性

图S6.Rosi处理导致ATMs分泌更多较小sEVs

图S7.Rosi-ATM-sEVs增强了所有胰岛素靶组织中AKT的磷酸化，并减少了促炎ATMs

4、Rosi-ATM-sEVs直接增强体外胰岛素敏感性

基于Rosi-ATM-sEVs对体内葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的显著影响，研究人员进一步探究了Rosi-ATM-sEVs是否也能增强体外胰岛素的作用。研究人员提取M0、M1或Rosi处理的M1-BMDMs的sEVs直接添加到3T3-L1脂肪细胞(图4A)、L6大鼠成肌细胞（小编注：L6和C2C12都是常用的成肌细胞，但其来源有所不同，L6肌细胞最初从大鼠的大腿肌分离得到，C2C12最初从小鼠的大腿肌分离得到）(图4B)或原代肝细胞(图4C)，24孔板中每孔加入10⁸个sEVs。Rosi-M1-BMDM-sEVs导致3T3-L1和L6细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取增强和 AKT 的Ser473磷酸化水平升高(图4D、E)。Rosi-sEVs还增强了胰岛素对肝细胞中胰高血糖素刺激的葡萄糖生成的抑制作用(图4C)。

作为另一种体外系统，研究人员从肥胖小鼠中分离出eWAT外植体，并从中获得sEVs进行研究，这些外植体分别用二甲基亚砜(DMSO)或10µM Rosi处理24 h。研究人员发现虽然来自DMSO处理的外植体的sEVs导致L6肌细胞中葡萄糖摄取减少，但来自Rosi处理的外植体的sEVs将胰岛素刺激的葡萄糖转运恢复到对照组水平(图S8A)。Rosi体外处理诱导eWAT外植体中PPARγ靶基因Cd36(图S8B)和M2-巨噬细胞标记物Mgl1表达水平上调(图S8C)。

对ATMs-sEV组的检测也证实了Rosi BMDM-sEVs的结果(图5)。研究人员发现Rosi-ATM-sEVs直接增加了胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞(图5A)和L6肌细胞(图5B)的葡萄糖摄取能力。Rosi-ATM-sEVs处理的细胞显示出胰岛素刺激的AKT磷酸化水平上调，而HFD-ATM-sEVs处理具有相反的效果(图5C、D)，并且经Rosi-ATM-sEVs处理的小鼠原代肝细胞胰高血糖素刺激的肝葡萄糖生成降低，胰岛素介导的对胰高血糖素刺激葡萄糖输出的抑制作用增强(图5E)。而HFD-ATM-sEVs体外处理导致胰岛素刺激的葡萄糖摄取受损(图5A、B)和肝脏胰岛素抵抗(图5E)。除此之外，研究人员发现Rosi-ATM-sEVs处理同样能够改善人原代肝细胞的胰岛素敏感性(图5F)。由于图5A-F中所有胰岛素靶细胞均正常且胰岛素敏感性完整，因此研究人员通过棕榈酸(PA)处理L6肌细胞来探究Rosi-ATM-sEVs是否能够改善胰岛素抵抗细胞中的胰岛素作用。PA处理导致胰岛素刺激的葡萄糖转运减少，Rosi-ATM-sEVs处理完全逆转了这一现象(图5G)。与胰岛素敏感性已经接近最佳的正常细胞相比，Rosi-ATM-sEVs在PA处理的胰岛素抵抗细胞中的作用更大。

图4.Rosi BMDM-sEVs在体外增强胰岛素敏感性

图5.Rosi-ATM-sEVs在体外直接增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取、肝细胞胰岛素敏感性和GSIS

图S8.Rosi-HFD eWAT explant-sEVs可逆转HFD eWAT explant-sEVs引起的L6肌细胞胰岛素抵抗

5、Rosi-ATM-sEVs促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌

虽然Rosi-ATM-sEVs处理的HFD小鼠中胰岛素水平的降低伴随着胰岛素敏感性的改善，但在Rosi饮食后研究人员观察到的胰岛素水平下降幅度更大(图5B-D)，这使得研究人员进一步探究了Rosi-ATM-sEVs是否能够增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌(Glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)。研究人员用Rosi-ATM-sEVs、HFD-ATM-sEVs或PBS脂质体孵育从HFD小鼠分离的胰岛，每10个胰岛用10⁸个sEVs孵育，发现Rosi-ATM-sEVs增强了GSIS，而与PBS脂质体相比，HFD-ATM-sEVs处理未导致GSIS发生变化。由于胰岛孵育中的细胞数量比先前用于胰岛素作用研究的细胞数量少了约5倍，因此研究人员使用Rosi-ATM-sEVs进行了剂量反应实验。在图4和图5中，每个肝细胞的sEVs剂量为1×10³个。于是研究人员用低剂量(每10个胰岛大约2×10⁷个sEVs，每个β细胞900个sEVs)、中剂量(每10个胰岛大约5×10⁷个sEVs，每个β细胞2250个sEVs)和高剂量的sEVs(每10个胰岛大约1×10⁸个sEVs，每个β细胞4500个sEVs)处理胰岛。研究发现基础胰岛素分泌未发生明显变化，然而在16.7 mM葡萄糖剂量时，Rosi-ATM-sEVs在三种剂量下都增强了GSIS，并且在高剂量sEVs下GSIS最大(图5I)。除此之外，研究人员还在精氨酸或GLP-1激动剂Exendin-4(Ex-4)处理的胰岛中检测了Rosi-ATM-sEVs，发现在精氨酸和Ex-4分别存在的情况下，Rosi-ATM-sEVs增强了胰岛素分泌。而仅在Ex-4存在的情况下胰岛素分泌也上调，即胰岛素分泌正常 (图5J)。以上结果表明，Rosi-ATM-sEVs可以增强胰岛素敏感性和GSIS。

6、Rosi-ATM-sEVs的miRNAs产生有益的代谢效应

sEVs的内容物由蛋白质、脂质、miRNAs和其他RNA种类组成。在先前的研究中，ATM-sEVs引发的代谢效应被归因于其miRNA含量。为了探究Rosi-ATM-sEVs中的miRNA对观察到的有益代谢效应的影响，研究人员使用siRNA沉默了Dicer（一种核糖核酸内切酶和miRNA生物发生的关键调节因子）以产生不含miRNA的sEVs，然后探究其对3T3-L1脂肪细胞和L6肌细胞葡萄糖摄取的影响。经检测，Dicer-knockdown (KD)模型沉默Dicer的效率约为90%(图6A)。与PBS脂质体相比，从用非靶向对照siRNA处理的Rosi-ATMs中分离的sEVs处理的细胞葡萄糖摄取普遍增加(图6B)。

相比之下，在小鼠(图6C)或人类肥胖肝细胞（图6D)中，不含miRNA的Rosi-ATM-sEVs(Rosi-Dicer-KD-ATM-sEVs)并没有增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取或改善胰岛素抵抗。研究人员还探究了sEV-miRNAs在增强胰岛GSIS中的重要性。研究人员使用Rosi-Dicer-KD-ATM-sEVs孵育HFD胰岛，并与PBS脂质体和Rosi-ATM-sEVs进行比较，研究发现Rosi-ATM-sEVs对GSIS的影响被Dicer-KD消除(图6E)。以上数据表明，Rosi-ATM-sEV miRNAs是胰岛素敏感性和GSIS增强的介质。

图6.microRNA货物负责Rosi-ATM-sEVs的有益效应

7、miR-690是Rosi-ATM-sEV代谢效应的关键分子

miR-690是“M2样”ATM-sEVs中的典型miRNA，其已被证明可以增强胰岛素敏感性。研究人员假设Rosi处理改变了ATM极化和转录谱(如图1和2所示)，使得Rosi-sEVs中miR-690的表达增加。

如图7所示，研究人员发现eWAT和SubQ ATMs中的miR-690在NCD小鼠中表达较高，在HFD小鼠中表达较低(图7A)。但体内Rosi处理HFD小鼠上调了miR-690的表达水平，使其在ATMs及其分泌的sEVs中的表达显著增加(图7A)。研究人员还发现CD11c⁺CD206^{neg to low}“M1样”和CD11c⁻CD206^high“M2样”Rosi-ATM亚群中miR-690表达水平较高(图S9A)。而Rosi-ATM-sEVs诱导的代谢效应主要归因于“M2样”Rosi-ATMs(图S9B)。此外，由于“M1样”Rosi-ATM-sEVs不再诱导胰岛素抵抗，这似乎也有助于总体有益代谢效应。值得注意的是，Dicer-KD-ATMs中的miR-690水平降低了90%(图7B)。

与M1-BMDMs和M1-BMDM-sEVs相比，miR-690在M2-BMDMs和M2-BMDM-sEVs中的表达显著上调，并且体外Rosi处理M1-BMDMs导致BMDMs及其分泌的sEVs中miR-690表达增强(图7C)，并且Rosi处理BMDM-sEVs中miR-690表达的上调幅度甚至大于BMDMs。这可能意味着miR-690选择性进入到Rosi处理的BMDMs的sEVs中。

为了证明这些效应是否依赖于PPARγ，研究人员使用靶向PPARγ的siRNA沉默Rosi处理的M1-BMDMs中的PPARγ，因为Rosi的体内胰岛素增敏作用在很大程度上依赖于PPARγ，研究人员发现PPARγ KD阻断了Rosi诱导的miR-690的表达和其靶基因NAD激酶(NAD kinase ,Nadk)的下调(图S9C)。此外，研究人员发现PPARγ KD抑制了Rosi介导的M2-巨噬细胞标记基因Mrc1和Mgl1的表达上调(图S9C)，并且与M1-BMDMs相比，PPARγ KD仍导致M1标记基因表达水平出现总体降低的趋势(图S9D)，同时PPARγ KD还阻断了Rosi-sEVs增加的肌管中葡萄糖摄取。

为了进一步明确miR-690在介导Rosi-ATM-sEVs引起的胰岛素敏感性中的作用，研究人员检测了miR-690及其靶基因Nadk在Rosi-ATM-sEVs.处理的L6肌细胞中的表达，发现用M1 + Rosi-ATM-sEVs或M2-BMDM-sEVs处理的L6细胞中miR-690表达升高，而与用M1-BMDM-sEV处理的L6细胞相比，Nadk在这两种处理条件下的表达均受到抑制(图S9E)。此外，研究人员使用miR-690模拟物、miR-690拮抗剂Antagomir和Rosi-ATM-sEVs在L6肌细胞中进行了体外葡萄糖转运试验，结果发现miR-690模拟物增强了胰岛素刺激的葡萄糖摄取，并且这种效应被miR-690拮抗剂的共处理所阻断(图7E)，此外miR-690拮抗剂还完全阻断了Rosi-ATM-sEVs对胰岛素刺激的葡萄糖摄取的刺激作用(图7F)。

Rosi-ATM-sEV和Rosi处理的小鼠血浆和肝脏中miR-690的循环水平相似(图S9F)，而与HFD-ATM-sEV处理相比，Rosi-ATM-sEV处理小鼠的肝脏中Nadk表达较低。此外，miR-690拮抗剂抑制了Rosi-ATM-sEVs对肥胖小鼠肝细胞胰岛素敏感性的有益效果(图7F)。这些发现表明，Rosi-ATM-sEVs的大部分胰岛素增敏作用可归因于Rosi诱导的miR-690表达增加。

在相似的实验中，研究人员使用miR-690模拟物或Rosi-ATM-sEVs(含或不含miR-690拮抗剂)处理HFD小鼠的胰岛，结果发现miR-690模拟物在高葡萄糖水平下引起类似于Rosi-ATM-sEV的GSIS的增加，而miR-69拮抗剂完全阻断了Rosi-ATM-sEV对GSIS的刺激作用(图7I)。与此一致，研究人员发现Rosi-ATM-sEVs和miR-690拮抗剂共处理或单独使用Rosi-Dicer-KD-ATM-sEV处理的胰岛中miR-690表达水平非常低，同时miR-690靶基因Nadk上调(图S9G)。

图7.miR-690是Rosi-ATM-sEVs代谢效应的关键因素

图S9.Rosi-巨噬细胞中miR-690的富集和Nadk的下调依赖于PPARy的激活

10、miR-690拮抗剂可阻断体内Rosi效应

除了上述体外研究外，研究人员还进行了体内研究，确定了Rosi处理对胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良在多大程度上归因于刺激 ATM-sEV-miR-690。于是研究人员从 HFD 喂养第 10 周开始，对肥胖小鼠联合给予Rosi和miR-690拮抗剂4周(每周两次)(图8A)，结果发现miR-690拮抗剂减弱了Rosi对葡萄糖耐量(图8B)和胰岛素敏感性的有益作用(图8C)。通过测量曲线下面积(AUC)，ITT中Rosi处理改善胰岛素敏感性的逆转率为53%(图8C)。如图8B所示，拮抗剂显著逆转了Rosi对葡萄糖耐量的改善，并且这种逆转效果在10-60分钟的早期时间点尤为明显。为了对此进行更定量的估计，研究人员分析了增量AUCs（小编注：由于不同处理组小鼠起始胰岛素水平不一致，因此作者使用增量AUC进行计算，这是血糖增量(Δ值)的曲线下面积），使用这种方法，研究人员发现与拮抗剂处理的Rosi小鼠相比，未经过处理的小鼠的基础葡萄糖水平更高，因此增量AUCs具有可比性，这表明Rosi效应几乎完全逆转，然而，由于血浆和葡萄糖水平的调控受多种因素影响，使外源变量对葡萄糖耐量的影响不能够被精确定量，因此这些AUC比较应被视为估计值。无论如何，使用miR-690抑制剂都会强烈逆转Rosi处理对ITTs和GTTs的有益作用。研究人员还发现与HFD组相比，Rosi和抑制剂处理的小鼠胰岛素水平均降低，同时与Rosi处理组相比，抑制剂处理组胰岛素基线水平更高，但后续并无显著差异(图8D)，研究人员推测这可能是小鼠的基础葡萄糖水平较低的原因。

HFD饮食下，Rosi处理能够恢复小鼠的脂肪、肝脏和骨骼肌样本中AKT磷酸化水平，而在拮抗剂处理的Rosi小鼠的脂肪、肝脏和骨骼肌样本中，Rosi上调的AKT磷酸化水平被显著逆转(图8E、图S10A)。这些结果证明了miR-690在Rosi对胰岛素信号传导的效应的主要贡献。除此之外，研究人员发现使用拮抗剂处理Rosi小鼠后，小鼠eWAT ATMs中的促炎细胞因子基因表达上调至与HFD相似的水平(图8F)。

拮抗剂Antagomir与靶miRNA结合可抑制miRNA功能，也可导致miRNA降解。与Rosi和抑制剂处理的小鼠相比，体内miR-690抑制剂处理导致ATMs中miR-690基因表达下调约70%，同时miR-690靶基因Nadk表达水平上调(图8G)。与Rosi处理小鼠相比，抑制剂处理小鼠的肝脏、肌肉和胰腺中也观察到类似结果，包括miR-690的降低和Nadk表达的增加(图S10B、C)。此外，研究人员发现NCD和Rosi处理小鼠肝脏中NAD⁺水平升高，与Nadk表达降低一致(图S10B)。并且用拮抗剂处理的Rosi小鼠的体重和红细胞比容水平未发生变化（图8A、图S10D），表明这些不利的TZD效应不是由ATM-sEV-miR-690介导的。总体而言，这些结果表明miR-690对Rosi导致的体内胰岛素敏感发挥着重要作用。

图8.miR-690拮抗剂处理Rosi小鼠的结果表明miR-690是Rosi体内效应的中介

图S10.miR-690拮抗剂治疗不会引起体重或红细胞压积水平的变化，但会增强AKT磷酸化并调节胰岛素靶组织中miR-690、Nadk的表达

总结

在本研究中，研究人员发现Rosi处理可改善机体葡萄糖稳态并增强胰岛素耐受性，同时Rosi处理促进eWAT ATMs的转录复极化和sEV分泌增加。Rosi-ATM-sEVs可在体内缓解肥胖引起的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗，而不会引起已知的TZDs带来的体重增加或水肿的副作用。Rosi-ATM-sEVs中miRNAs，主要是miR-690介导了Rosi-ATM-sEVs带来的代谢效益。因此，使用带有特定miRNAs的ATM-sEVs可能为诱导胰岛素致敏提供了一条治疗途径。

文章链接:https://www.nature.com/articles/s42255-023-00934-4

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