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狂犬病毒糖蛋白抗体的检测与定量:现状与展望（4）
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狂犬病毒糖蛋白抗体的检测与定量:现状与展望（4）
抗原结合检测（Antigen binding assays）（i)
除了VNA（狂犬病毒中和抗体）检测，其他类型的方法通常被称为抗原结合检测（Antigen binding assays），已经广泛应用于狂犬病血清学检测。在这些检测中，抗体存在于血清、血浆或其他体液中，通过其与狂犬病G蛋白结合的能力进行评估，G蛋白可以是从整个病毒中纯化的，或重组表达的，也可以是在人工合成的在G蛋白氨基酸序列中可代表抗原表位（epitopes）的多肽。
目前已经开发和验证了多种ELISA（酶联免疫吸附试验）方法用于血清学检测(表1)。目前，ELISA检测被认为是狂犬病血清学更合适的替代方法，在多个实验室提供了一致的结果，特别是对PEP（暴露后预防）抗体效价的定量测定和不同野生动物储存宿主血清流行病学调查。此外，ELISA还可用于定量接种疫苗后人抗狂犬病抗体的滴度。
血清学方法中使用的ELISA有几种类型，它们在抗原(Ag)-抗体(Ab)检测方式上有所不同。此外，还有多种检测系统，如与辣根过氧化物酶(HRP)交联的生物素-亲和素(biotin-avidin)系统、与HRP结合的二抗、能识别Igs Fc部分的与HRP交联的细菌蛋白A/G等。这就是为什么阐明ELISA检测方法的每个步骤可以帮助我们正确地解释结果。
表1. 已发表的用于检测和定量抗狂犬病糖蛋白抗体的抗原结合检测概览
序号 | 试剂盒 名称 | 类型 | 包被抗原 | 检测系统 | 适用动物物种 | 分析方法和参数 | 参考文献 |
1 | SERELISA试剂盒（狂犬病单克隆抗体间接检测） | 定性间接ELISA
| 灭活狂犬病毒G52株(巴斯德衍生物)
| HRP－蛋白A | 家养食肉动物 | 对50%的参与者缺乏敏感性，假阳性结果占25% (N=16个实验室)。参考方法：FAVN / RFFIT) | Cliquet et al. (2004); Servat and Cliquet (2006) |
2 | PLATELIA®狂犬病II代试剂盒 | 定性或半定量/定量间接ELISA | 纯化病毒(PV株)糖蛋白 | HRP－蛋白A
| 人 | 98.6%的敏感性;99.4%特异性(阈值:0.5 IU/mL;参考方法：RFFIT）LOD: 0.05 EU/mL (0.5 IU/mL相当于0.5EU/mL) | Feyssaguet et al. (2007) |
3 | PLATELIA® 狂犬病II代试剂盒(ad usum veterinarium兽用产品) | 定性或半定量间接ELISA
| 纯化病毒(PV株)糖蛋白 | HRP-交联链霉亲和素－蛋白A(来自金黄色葡萄球菌) | 家养食肉动物和野生动物 | 78.2%的敏感性;100%特异性(阈值:0.5 EU/mL。协作研究。参考方法:FAVN) | Servat et al. (2007); Wasniewski et al. 2014 |
4 | cELISA （竞争性ELISA） | 定量竞争性ELISA | 单克隆抗体D1
| 用HRP标记单克隆抗体D1 | 马属Igs (ERIGs)和人类(HRIGs) | 线性：F(ab)2- ERIGs批次为430和861 IU/mL, HRIGs批次为175和350 IU/mL | Korimbocus et al. (2016) |
5 | BioPro®狂犬病ELISA抗体试剂盒
| 定性阻断性ELISA | 粗制狂犬病糖蛋白 | 链霉亲和素－生物素 | 狐狸和貉（racoon dogs） | 100%敏感性(N=20个实验室)/95.8－97.9%敏感性(N=5个实验室)，100%特异性(N=21个实验室)/66.7 93.3%特异性(N= 4个实验室)(阈值:阳性占40%。协作研究。参考方法：FAVN) | Wasniewski et al. (2016) |
6 | bELISA （阻断性ELISA） | 定量bELISA | 纯化RV-VLPs（病毒样颗粒） | HRP交联链霉亲和素 | 多种动物 | 线性关系：0.148－1.0 IU/mL，LOD: 0.06 IU/mL（人狂犬病Igs，欧洲药典参考标准)。证实了准确性(MNT（小鼠中和试验）, Platelia®) | Fontana et al. (2020)
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7 | ECL | 定性ELISA技术
| 碳电极包被纯化糖蛋白G
| 磺基标记链霉亲合素
| 人、狗、浣熊(生物素标记的针对不同物种的IgG) | 100%的敏感性。对人体样本的特异性为95%。对野生动物样本的敏感性96%，特异性为95%(阈值：0.15 IU/mL。参考方法:RFFIT) | Ma et al. (2012) |
8 | RAPINA
| 定性免疫层析法 | 与胶体金交联的抗G单抗 | 红色条带形成：VNAs水平不足 | 人 | 敏感性为100%。特异性98.34（参考方法：RFFIT) | Thi Nguyen et al. |
表1的英文原文：
间接ELISA (iELISA)检测
在间接ELISA (iELISA)检测方式中，Ag（抗原）在检测的第一步中被固定在固相孔上，然后，孵育样品(包含狂犬病Igs)允许Ag-Ab（抗体）相互作用。检测系统通常包括与辣根过氧化物酶（HRP）结合的二抗。这种二抗可能是物种特异性的，这可能限制了检测的通用性、Igs特异性(通常是抗IgM或抗IgG)，或识别Abs的Fc部分，因为采用了与HRP交联的蛋白A/G系统。
后一种检测系统的主要优点是该方法可以应用于不同物种的样品。然而，A/G蛋白并不是与所有Igs亚型具有相同的亲和力，而且在不同物种之间也存在差异;事实上，众所周知，蛋白A优先与IgM或IgG结合，但不与IgG3亚类结合。因此，Abs定量(或检测)可能会根据样本(类型、时间、物种)而有所不同；因此，在这类分析中必须特别小心，主要是在对检测结果进行解释时。
另一方面，如果研究的目的是确定狂犬病感染过程中或接种狂犬病疫苗后IgG/IgM的比例，采用抗IgM和抗IgG的检测系统是非常可取的。然而，如果目标是开发一个良好的VNAs估计方法，后者不是最好的，因为已经确定只有IgGs可以对RABV感染提供中和和保护。IgM的功能可能由于其五聚体结构而受到限制：IgM的组织穿透能力很弱。
两种商业化的iELISA（间接ELISA）检测是基于HRP 交联A蛋白： SERELISA(狂犬病单克隆抗体间接检测试剂盒)和PLATELIA II代狂犬病检测试剂盒(Bio-Rad产品)。有几篇报道将其结果与VNA检测结果进行了比较。世界动物卫生组织（OIE）将SERELISA检测描述为一种筛查工具，用于控制接种过疫苗的狗和猫的狂犬病抗体，但由于敏感性太低，所有阴性结果必须在VNA试验中得到确认。
进一步的合作研究表明，一些实验室的假阳性结果率很高。关于狂犬病2代PLATELIA试剂盒(已通过WHO认证)，feysaguet et al. 2007将其描述为一种定性和半定量的检测方法，它与接种和未接种的人血清样本的RFFIT测试具有良好的相关性。此外，Welch 等在人血清样本中描述了PLATELIA®和RFFIT检测之间的良好相关性，并且比另一种间接ELISA试剂盒DGR狂犬病毒IgG Ab ELISA (DRG International产品）和RFFIT检测之间的相关性更好。
此外，PLATELIA 2代试剂盒(adusum veterinary的兽用产品)对家养和野生食肉动物PEP（暴露后预防）的评价结果也不同。Servat等人建立了0.5 EU/mL的阈值(与0.5 IU/mL一致)，并验证了这些检测，获得了与FAVN检测良好的相关性。相反，对家养食肉动物宠物样本的大规模研究与上述研究有显著不同，建立了一个新的临界值0.3 EU/mL，以保持分析的敏感性，但降低了其特异性。
这些研究之间的差异可能是由于试剂盒制造过程中的某些修改或变动。
（未完待续）
参考文献:
Rodriguez MC, et al., Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Sep;105(18):6547-6557. DOI: 10.1007/s00253-021-11515-4
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