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最可怕的狂犬病毒－莫科拉病毒的多样性和流行病学

2019-8-17 16:50

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标签：莫科拉病毒, 狂犬病毒, 多样性, 流行病学

前一篇博文曾介绍，新型狂犬病毒莫科拉丽沙病毒（Mokola lyssavirus， MOKV）确实是已知最可怕的新型狂犬病毒。因为MOKV作为狂犬病毒不仅病死率高，迄今为止尚无有效疫苗，而且它确实曾引发两例人类死亡病例（更正：后来证实其中仅一例死亡）。

据目前所了解的情况，莫科拉丽沙病毒只存在于非洲，且与蝙蝠无关。目前MOKV实际上对整个人类社会构成的威胁还非常小。

但为了防患于未然，我们还是希望能对该病毒有更多的了解。

对于经典的狂犬病毒(RABV)以外的新型狂犬病毒，尽管迄今总共已发现了十多种，但由于总的发病率非常低，主要只存在于野生哺乳动物中（绝大多数新型狂犬病毒都以蝙蝠为储存宿主），引发的人类病例非常罕见，而且这些新型狂犬病毒主要只存在于非洲，所以数十年来，对这些病毒的研究进行得很少，相关研究资料非常欠缺。其中有的病毒样品只获得过一次，甚至有的原始样品已经丢失，无法作进一步的研究。

相对而言，对莫科拉病毒（MOKV）的研究资料还是比较丰富的，因后来有较多莫科拉病毒的样品在南非共和国境内及邻近地区被发现，而南非的经济和科研水平在非洲又是较高的。

南非的研究人员曾与英国和德国的相关研究人员合作，对以往获得的20多个莫科拉病毒样品进行全面梳理，对其中的18个样品进行了较系统全面的分析和研究。

以下介绍他们于2013年发表的相关研究论文的主要内容。

论文题目：莫科拉病毒的多样性和流行病学

（Diversity and Epidemiology of Mokola Virus）.

发表的杂志： PLoS Negl Trop Dis.　2013， 7(10): e2511.　doi:10.1371/journal.pntd.0002511

作者的概述

根据世界卫生组织的观点，狂犬病被认为是一种被忽视的人畜共患病和热带疾病。在目前已知存在的所有丽沙病毒中，莫科拉病毒是一种独特的病毒，似乎只存在于非洲。与所有已知的弹状病毒科丽沙病毒属的病毒相比，其储存宿主尚未确定。由于此前只能获得非常有限的序列信息，本研究对了解Mokola病毒的遗传多样性和亲缘关系具有重要意义。对世界各地的狂犬病实验室迄今分离到的所有Mokola病毒的完整核蛋白、磷蛋白、基质和糖蛋白基因都进行了测序。进行了系统发生分析，确定了最近的共同祖先。随后，将结果与流行病学背景数据相关联。我们还对这些基因中被认为对病毒特性有影响的不同抗原位点进行了比较研究。

摘要

Mokola病毒(MOKV)似乎只存在于非洲。尽管最早分离到的第一批病例来自尼日利亚和刚果盆地其他国家，但在过去20多年的所有报告均来自南非。由于只能获得有限的MOKV的序列信息，且分离株分布在不同的实验室中，以往的系统发生研究只分析了很少的几个分离株或只能使用不完全的基因序列进行分析。本项研究对各实验室18株MOKV分离株的全部核蛋白、磷蛋白、基质和糖蛋白基因进行部分测序或全基因组测序，并进行系统发生分析。

结果表明，来自南非、津巴布韦、中非共和国和尼日利亚的MOKV分离株，无论用于系统发生分析的基因是什么，均按地理来源簇聚（clustered）在一起，与在拉各斯蝙蝠病毒（Lagos bat virus）中观察到的情况相似。贝叶斯马尔可夫链（Bayesian Markov-Chain-Monte-Carlo-(MCMC)）分析显示，MOKV最近的共同祖先(MRCA)的年龄在279岁至2034岁之间，这取决于所使用的基因。一般来说，所有MOKV分离株在被认为对病毒特性有影响的氨基酸位点上都显示出类似的模式。

前言

丽沙病毒属由国际病毒分类委员会（ICTV）承认的12种病毒组成，其中5种：狂犬病病毒(RABV)、Lagos bat病毒(LBV)、Mokola病毒(MOKV)、Duvenhage病毒(DUVV)和Shimoni bat病毒(SHIBV)已在非洲分离得到。其中LBV、MOKV、DUVV和SHIBV只发生在非洲。

首次分离MOKV是在1968年和1969年，从尼日利亚的鼩鼱器官中获得。仅有的源于人类的分离株是1968年和1971年来自尼日利亚的两名女孩。然而，在这两例中都没有狂犬病的典型症状。1968年的分离物是从一名出现发烧和抽搐但后来完全康复且没有神经损伤的女孩的脑脊液中分离出来的，而1971年的分离物是从一名死于类似脊髓灰质炎的脑病的女孩的大脑中分离出来的。1974年，从喀麦隆的一只鼩鼱又获得一个分离株。

唯一一次从啮齿动物(Lophuromys sikapusi)身上分离出MOKV是在1981年，分离地点是中非共和国的班吉。MOKV也从包括伴侣动物在内的其他动物中分离得到。1981年至1984年在津巴布韦进行的一项关于丽沙病毒的调查显示，从家畜中分离出6株MOKV，即以前接种过狂犬病疫苗的狗和猫以及未接种疫苗的猫。

1989年，MOKV从埃塞俄比亚首都亚的斯亚贝巴的一只猫身上分离出来。到1993年，津巴布韦才再次从一只家猫中分离出MOKV。在南非共和国，1970年对一只家猫进行了第一次分离。当时，该分离株被假定为RABV，并且该分离株仅在上世纪80年代津巴布韦发现MOKV期间，使用单克隆抗体进行抗原分型进行回顾性鉴定。25年后的1995年，MOKV从南非的一只家猫身上分离出来。随后在1996年又进行了两次分离，两次都是从家猫身上分离出来的，其中一次是从接种了狂犬病疫苗的猫。

1997年和1998年，在南非的KZN地区又从接种了狂犬病疫苗的猫身上获得3个分离株。在没有发现MOKV的几年后，2006年和2008年从南非EC省接种了狂犬病疫苗的家猫中分离出两种病毒，这是该病毒的最新已知分离株。从南非分离的所有MOKV均来源于同一只家猫。采用PCR方法从南非普马兰加省的一只家犬(2005年)身上检测到病毒RNA，但在本例中病毒分离不成功。

图1总结了所有MOKV毒株来源的大致地理位置。

图1　非洲地图，显示获得MOKV分离株的位置。

说明：红点旁边的数字表示在相同位置(或在相近位置)获得的分离株的数量。

一般来说，MOKV感染的家畜没有被观察到特别具有攻击性，但表现出其他类似于狂犬病的症状，包括脱水、异常行为、过敏、神经紊乱和唾液分泌过多。尽管MOKV是从多种哺乳动物中分离出来的，但它是唯一从未从蝙蝠中分离出来的丽沙病毒。

曾有多项研究报告，狂犬病疫苗能针对各种狂犬病相关丽沙病毒具有交叉保护作用，世卫组织和世界动物卫生组织也作过此类推荐。然而，没有狂犬疫苗能针对MOKV提供完全的保护作用。更多的证据表明，RABV衍生的疫苗不能针对MOKV感染提供保护。特别是有大量间接证据表明，许多已接种了RABV疫苗的家畜仍会发生致命的狂犬病感染。鉴于出现了这些情况，同时考虑到对MOKV的相关研究极为欠缺，我们认为需要获取更多的信息来改善我们对这种病毒的流行病学、疾病动力学和生态学的了解。

对MOKV曾尝试进行过某些系统发生方面的研究，但这些研究只是在较少的分离株上进行，并且仅限于部分基因序列。尽管有这些限制，这些研究提供了一些证据，证明不同的病毒簇群（cluster）的存在，可根据地理分布来划分。一般来说，遗传变异率与分离株的空间分布呈负相关。例如，南非的MOKV分离株被证明是密切相关的，但可以根据省份进行区分，并且作为一个簇群与邻国津巴布韦出现的MOKV分离株距离更远。这种遗传多样性的模式可能表明了较长时间的分离的进化过程，正如已报道的在陆生动物狂犬病毒的变异株中所发生的情况。一个例外似乎是一个包括一个喀麦隆分离株和一个埃塞俄比亚分离株的分组。

本文报道的研究涉及多个实验室之间的多学科合作，旨在首次建立所有已知MOKV分离株的全面的数据库。我们已经证明，文献中提到的大多数病毒，但不是所有的病毒都能被追踪到，而且出现了一些污染或命名错误。本研究最终选定了18株MOKV分离株，目的是对核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)和糖蛋白(G)进行全基因测序。

病毒谱系分化时间的估计以及随后分子钟的应用取决于对核苷酸取代率的准确估计。使用马尔可夫链 (MCMC)方法的贝叶斯技术已成功地应用于估计RABV的进化速度和序列歧异发生的时间。本研究利用放宽限制的分子时钟对N-、M-、Ｐ-和Ｇ -基因数据集进行研究，以估算MOKV最近的共同祖先(most recent common ancestor，MRCA)存在的时间和进化速率。随后的分析将有助于对这种非洲丽沙病毒的系统发生和多样性的研究。

结果

我们已经生成了一个完整的MOKV所有目前可获得的分离株的数据集，但是我们无法对其中一部分进一步进行跟踪。在过去50年报道的24份MOKV检测报告中，只有18份被纳入本研究。我们无法追踪已有文献报道的4例病毒分离株。其中三例是来自尼日利亚的早期病例，其存在现在还不确定，即两例人类分离株和另一例来自鼩鼱的分离株。

第四例是最近从南非报道的一例与狗有关的病例，从未从其中获得一种分离株。从MCC系统发生分析序列数据库中排除了分离株RV39(喀麦隆,1974)和RV610(埃塞俄比亚,1990)，因为我们手中拥有的这些分离株可能是雷同的病毒株。某些基因中少量的核苷酸差异被认为是由于在多年的实验室维护过程中因在细胞培养中多次传代而引入的突变。

丽沙病毒基因组上的许多区域与丽沙病毒分离株之间以及丽沙病毒属中不同种的病毒分离株之间的毒力有不同程度的关系。大多数MOKV分离株在特定位点上都存在类似的氨基酸取代模式，存在特异性差异。通过构建MCC树，利用N、P、M、G基因序列的串联全编码区域以及单个基因，可确定不同MOKV毒株之间的遗传关系。

在本项研究中分析的MOKV分离株依据自举值（bootstrap values）可形成一个簇群。MCC树表明，各分离株按地理位置分组。从南非和津巴布韦分离的MOKV毒株的系统发生分析表明，地理聚类与以前的研究结果一致。

图２　　基于MOKV分离株和典型丽沙病毒分离株完整N、P、M、G基因串联核苷酸序列的MCC系统发生树。

南非分离株分别由KZN省和EC省组成两个簇群。津巴布韦从20世纪80年代分离出来的病毒(全部来自布拉瓦约)形成了一个单独的簇群，与1993年从Selous分离出来的病毒截然不同。无论用于系统发生分析的基因是什么，这些分离株(南非和津巴布韦)都显示出相同的分组。无论用于分析的基因是什么，中非共和国和尼日利亚分离株都形成了独立的簇群。

P-距离比较不同MOKV分离株都使用了N基因核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列比较表明MOKV分离株之间的差异是介于0和15% (即85% 的核苷酸序列相同)，最高的差异(15%)出现在分离株U22843(津巴布韦)和分离株RV4(尼日利亚)之间。

南非分离株相互之间的核苷酸差异最高为5.7%，而津巴布韦分离株的核苷酸差异最高为12.3%。总的来说，南非分离株和津巴布韦分离株之间的核苷酸差异为14.4%。在比较MOKV株间氨基酸差异时，也观察到相同的趋势，MOKV基因型内毒株间总体的氨基酸变异为6.4%。

讨论

本项研究的目的是进一步了解一种独特的非洲丽沙病毒MOKV的系统发生和多样性。我们的目标是要包括历史上发现的所有的MOKV，但已报道过的某些病毒和/或分离株的存在或身份无法得到证实，其中包括早期从尼日利亚报告的3个病毒分离株，其存在现在受到怀疑。从南非近日报道的一个分离株的情况也是如此。同样不幸的是，从喀麦隆和埃塞俄比亚分离出来的毒株也被排除在这项研究之外，因为我们手中现有的这些病毒很可能是来源于同一个库存。

尽管如此，一个由18个MOKV组成的全套病毒是在近50年的时间里被分离出来的，因此本项研究代表了对MOKV的全长的N、P、M和G基因最全面的系统发生分析。对从南非KZN省在28年期间获得的分离株的分析表明，在该地理区域内同一病毒谱系能持续存在并具有稳定性。这个KZN分组与另一个来自EC省的南非MOKV分组是有区别的，但是这两个MOKV分组的最近共同祖先(MRCA)的差异时间点比较近，大约在150年左右。

观察到的序列多样性似乎也决定了分离物的生物学特性。在小鼠中进行的平行实验感染研究表明，MOKV分离株的致病性被低估，尽管无法确定具体的标志物。我们使用一组更系统的序列数据进行的分析证实了这些结果，但是相关性还需要进一步的研究来证实。

对MOKV最近共同祖先(MRCA)的估计，利用不同基因得到的结果是范围从591年到1883年不等。

迄今为止，在40多年的时间里，已对6个非洲国家进行了23次MOKV分离和1次ＰＣＲ鉴定。由于这些非洲国家分别位于彼此相距遥远的非洲地区，MOKV很可能也存在于其他许多非洲国家，并分布在非洲大陆的大部分地区。此外，在过去近20年里，MOKV只从南非分离出来。由于已知MOKV不可能只局限于在南非才有，在其他地方没有分离到MOKV只能说明在整个非洲还没有适当的疾病监测，包括对狂犬病毒的监测。

整个非洲大陆有限的诊断能力(例如对狂犬病病例/样本/分离株的分型或测序)仍然是一个关键因素。如果能加强监测，可能会发现更多的分离株，从而展示MOKV更大的多样性，并增进我们对MOKV发病率和流行状况的了解。由于狂犬疫苗不能提供针对MOKV的保护，因此更有必要进一步深入了解MOKV的生态学。研究MOKV的一个限制因素是，尚不清楚这种病毒的储存宿主是何种动物。虽然鼩鼱可能相关，但目前还只能是推测。

丽沙病毒属的病毒大都与蝙蝠有很密切的联系，在这方面MOKV可能是唯一的例外，这似乎很奇怪。事实上，在食果性蝙蝠的血清中已经检测到既能中和LBV又能中和MOKV的病毒中和抗体(VNA)。然而，在血清学检测中，LBV和MOKV属于同一个遗传谱系II，有报道称它们会发生交叉反应。由于有关于果蝠LBV分离的重复报道，因此蝙蝠血清对MOKV的中和活性显然还不能证实MOKV在这些蝙蝠物种中的传播。

然而，不能排除其他未经鉴定的非洲蝙蝠可能作为MOKV的储存宿主。另一方面，家养猫和小型哺乳动物中MOKV的持续接触引发了对猎物-捕食者传播途径的猜测。对于MOKV，我们研究中估计的最近共同祖先(MRCA)与陆生动物狂犬病的出现时间相吻合，并为其提出的时间框架提供了支持。MOKV有可能在现存的非洲宿主环境中保持稳定，而RABV的进化由于宿主机会过多和全球分布而大大加快。

参考文献全文下载：

Diversity and Epidemiology of Mokola Virus.PDF