Quantitative proteomic analysis of iron-regulated outer membrane proteins in Aeromonas hydrophila as potential vaccine candidates
嗜水气单胞菌的铁调节外膜蛋白作为候选疫苗的定量蛋白质组学分析
发表期刊：Fish & Shellfish Immunology
影响因子：4.581
发表时间：2017.07
发表单位：福建农林大学
研究手段：TMT Western印迹
研究背景：在铁限制条件下培养的嗜水气单胞菌的铁调节外膜蛋白（OMP）组分比在正常条件下培养的OMP组分具有更有效的免疫保护作用，表明其作为疫苗的潜力。然而，其内在的功能成分在很大程度上尚不清楚。
研究手段：
1、嗜水气单胞菌ATCC7966在含或不含2,2-dipyridyl（DIP，一种金属螯合剂）培养基培养，OMP组分采用的肌氨酸不溶性法制备。
2、分离出来的蛋白先进行消化，接着用TMT试剂进行标记，脱盐后进入液相色谱-质谱联用仪器进行定量分析。根据GO和KEGG对含量变化的蛋白质进行生物学功能和相关过程分析，获得候选蛋白。
3、将候选蛋白对应的基因克隆到质粒，随后提取纯化重组蛋白。将纯化后的蛋白（抗原）对小鼠进行免疫，获得特异性抗体。来自嗜水气单胞菌ATCC7966和嗜水气单胞菌LP-1的蛋白质样品分别用200 mM的DIP处理后，进行Western 印迹验证。
4、将候选蛋白接种到斑马鱼肌肉免疫7天和14天后，接种10倍LD50的强毒力嗜水气单胞菌LP-1，14天后评估死亡率。
研究发现：
1、相比于铁正常的培养基，嗜水气单胞菌ATCC 7966在铁限制的培养基中产的OMP在SDS-PAGE凝胶上出现了几个突出的条带，这表明两种条件下的蛋白质组成不一样。采用高分辨率质谱对酶切肽进行了分析，目的是找出差异的蛋白质。质谱结果显示肽段的实际质量与理论质量误差接近于零，大部分小于0.01Da，说明质谱仪状态良好；两个生物重复之间有高的关联性，证明了方案可靠。DIP处理组（缺铁）与对照组（铁正常）共鉴定了676个蛋白质，其中91个上调蛋白，83个下调蛋白，使用GnegmPLoc计算机程序分析发现，在这些蛋白中，有21个和10个OMPs的表达分别增加和减少。
为了了解缺铁对上调或者下调的蛋白质影响特征，用GO分析了改变的蛋白。结果显示，上调的蛋白的生物过程最丰富的GO项目与多糖和脂多糖的代谢/生物合成过程、铁载体、铁配合实体和铁螯合转运有关（B），而下调的蛋白最丰富的GO项目是翻译、蛋白质和肽的代谢/生物合成过程（A）。
为了进一步研究这些改变的蛋白质的行为，根据其在GO和KEGG富集的比例，将其分成了四类。如下图，在缺铁培养基中，许多细胞外和OMPs在细胞中的组分（A），生物过程中的多糖代谢/生物合成过程相关蛋白（B）、受体活性和分子传感器活性（C）有所增加，而细胞成分中的细胞质蛋白（A），生物过程中的翻译和代谢/生物合成过程（B），氧化还原酶活性和硫簇结合（C）有所下降。在KEGG分析（D）中，在缺铁条件下，铁载体非核糖多肽和氨基酰基tRNA的生物合成，β-内酰胺抵抗，和细菌分泌系统相关的蛋白质是上调蛋白中最富集的途径，而核糖体和氧化磷酸化过程被下调。
亲铁饥饿的功能富集聚类。(A)e(D)本研究中的可量化蛋白按其比例分为Q1、Q2、Q2、Q4以下四个定量类别。用p<为0.01或0.05绘制了GO_CC（细胞组分）、GO_BP（生物过程）、GO_MF（分子功能）和基于KEGG富集的聚类分析。
由于蛋白质互作用（PPI）网络在生物过程中起重要作用，结合KEGG通路富集，预测了PPI网络。许多上调的蛋白（红色）与铁载体、抗生素和次级代谢物以及非核糖体肽的生物合成有关，而下调的蛋白（绿色）与核糖体RNA的合成和翻译有关。
生物信息结果分析的这些蛋白的改变是合理的，许多铁载体是由非核糖体肽合成酶生物合成，因此上调的蛋白可能参与了铁载体介导的铁代谢；同时，缺铁过程中多糖和脂多糖的增加会增强细菌的毒性或影响生物膜的形成。下调的蛋白质的活性需要铁作为辅助因子，因此它们的表达减少会导致铁的消耗量减少。同时，翻译过程的减少导致了蛋白质生物合成量的下降，这可能有利于细菌的生存，因为在不利的环境条件下消耗的能量较少。这些结果说明了菌株在缺铁状态下的调控机制。
PPI网络结合KEGG途径富集分析亲水弧菌在铁条件下改变蛋白的情况。
蛋白质组学及生物信息分析找到了上调和下调的蛋白及其对应的机制，疫苗的筛选依据这两部分信息进行选择。我们发现了一个有趣的现象，一些OMPs作为受体参与了铁的获取，例如A0KGW8(假定的外膜血红素受体)、A0KFG8(tonb依赖的铁载体受体)、A0KQ46(大肠杆菌素I受体)、A0KJP9(tonb依赖的铁载体受体)和A0KQZ1（铁体受体）显著增加，这些蛋白在嗜铁饥饿中的增加表明了它们在铁稳态上的生物学功能。此外，我们还发现了A0KIU8的改变与上述四个蛋白一致，因此这5个OMPs共同被考虑到下一步的研究。
2、了验证蛋白质组学的结果，将5种OMPs进行重组并获得相应的抗体。对进行不同铁含量培养的嗜水气单胞菌进行Western 印迹验证，结果表明，在缺铁时，上述5个OMPs显著增加，特别是A0KQ46和A0KQZ1。这表明，铁限制条件可能刺激铁相关蛋白的表达，这可能是筛选重组OMPs候选疫苗的有用条件。
3、 用强毒力的菌株LP-1对斑马鱼进行攻击，发现与对照组相比，0KQZ1、A0KQ46、A0KQ46、A0KGW8、A0KIU8和A0KFG8免疫保护下的相对生存率(RPSs)分别为60.7±4.7%、54.9±1.1%、43±7%、68.6±0.6%和63.4±3.4%，表明这些蛋白具有高效的免疫保护作用。
研究结论
利用定量蛋白质组学系统地研究了铁饥饿对嗜水气单胞菌OMPs的影响。许多上调的蛋白的免疫保护在斑马鱼中进行了测试，结果发现具有相当大的疫苗效力。因此，低铁诱导的OMPs是一种很有前途的候选疫苗，并为发现重组蛋白候选疫苗提供了一种新的策略。
文章链接：http://dx.doi.org/10.1016/j.fsi.2017.07.002
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