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王钊课题组用cryoET方法解析AcrAB-TolC原位结构至亚纳米分辨率

已有 616 次阅读 2021-9-14 09:33 |个人分类:小柯生命|系统分类:论文交流

美国贝勒医学院生物化学与分子生物学系王钊课题组用electron cryo-tomography(cryo-ET)方法,首次解析出大肠杆菌多药外排泵AcrAB-TolC在细菌胞外被膜上亚纳米分辨率的原位结构(7 Å),揭示了外排泵发挥功能的分子机制,证实了cryo-ET在原位结构研究方面的绝对优势,为其它外排泵高分辨率原位结构的解析指明了方向。


2021年9月9日,Structure在线发表了这一研究成果。贝勒医学院生物化学与分子生物学系王钊教授为该文的通讯作者,陈牧原石小东于智丽为共同第一作者。


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革兰氏阴性菌的耐药性是困扰世界各国的一大难题,常导致常用的抗生素失去杀菌作用,为临床上抗感染的治疗带来了严峻挑战。RND (Resistance-nodulation-cell division)家族外排泵能够有效地外排多种抗生素,是许多临床相关的革兰氏阴性菌多重耐药的主要决定因素。这类外排泵横跨细菌内外膜和膜间质地,由外膜通道蛋白、膜间质蛋白和内膜外排转运蛋白三部分组成。AcrAB-TolC是RND家族中最著名的外排泵复合物,由外膜通道蛋白TolC、膜间质蛋白AcrA和内膜转运蛋白AcrB组成。

 

在2019年,王钊团队首次报道了大肠杆菌多药外排泵AcrAB-TolC的原位结构,揭示了其在细胞内的组装机制。然而,当时解析出来的原位结构分辨率只有15 Å,其提供的结构信息不足以理解原生细胞环境对AcrAB-TolC各组分及其变构方式的影响。经过一年多的努力,王钊团队通过优化制样方法、改进数据收集方式,以及使用新开发的的EMAN2软件,最终成功解析出7Å分辨率的AcrAB-TolC外排泵原位结构(见图1)。


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图1. AcrAB-TolC多药外排泵亚纳米分辨率的原位结构

 

在亚纳米分辨率之下,TolC通道的下部分以及AcrA的上部分都可以看到许多α螺旋,体外的高分辨结构可以做到很好地拟合。和冷冻电镜单颗粒方法等体外结构生物学方法获得的结构不同的是AcrA的近膜结构域,可能是由于在体内存在和膜的相互作用,整体发生了逆时针方向8°的旋转(从胞外向胞内观察)。从密度图上来看,外膜的外层明显厚于内层,表明外膜的外面存在多糖层,而TolC穿越了外膜以及外膜外侧的脂多糖。由于TolC、AcrA、AcrB在复合物中的比例为3:6:3,理论上TolC三聚体相对于AcrB三聚体会存在两种可能的转向,即TolC三聚体有一个60度的旋转。在高分辨原位结构中,确实观察到这两种复合物的存在,不过二者所占比例大概持平。值得一提的是,从AcrAB-TolC亚纳米分辨率的原位结构中观察到了AcrA的末端,该部分结构在以往发表的AcrAB-TolC结构中都是不可见的。


更为有趣的是,在AcrAB-TolC亚纳米分辨率的原位结构里,AcrA的末端明显地打破了六重对称性。六个AcrA的末端无论是只和AcrB相互作用,还是和AcrB以及内膜均相互作用,都表现两种不同的构象。此外, AcrA展现出和AcrB更为广泛的相互作用,尤其是AcrA 原体II末端区域和AcrB的PC2亚区相互作用。PC2亚区在AcrB从结合态到挤压态,以及从挤压态到进入态的转换中均经历了很大的构象改变。于是王钊团队提出了AcrAB-TolC外排泵通过构象改变进行药物外排的机制(图2):AcrA的原体 II末端和AcrB的porter domain的PC2亚区的相互作用,以及AcrA原体I 和内膜的相互作用可能一起起始了AcrB从结合态到挤出态,从挤出态到进入态转变过程中构象变化的传递。

 

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图2. 在药物传输中AcrA将构象改变的信号从AcrB传递到TolC的模型

 

本研究提示,AcrA可以作为传递蛋白构象改变的通路,将AcrB结合和运输底物时产生的构象改变传递到TolC,影响TolC通道的开关。本研究展示了原位cryo-ET是揭示细菌多药外排泵的结构与功能的重要技术手段。

 

相关论文信息:

https://doi.org/10.1016/j.str.2021.08.008



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