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华中科大史岸冰课题组揭示RTKN-1/Rhotekin维持内吞体上微丝架构完整性
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北京时间2021年4月12日，华中科技大学基础医学院史岸冰课题组在Journal of Cell Biology （JCB）在线发表论文——“RTKN-1/Rhotekin shields endosome-associated F-actin from disassembly to ensure endocytic recycling ”（RTKN-1/Rhotekin通过稳定内吞体上微丝网络结构来调控内吞循环运输）。
该研究发现RTKN-1/Rhotekin缺失后内吞循环运输发生严重紊乱，且微丝骨架完整性受到破坏。RTKN-1通过其PH结构域定位于循环内体，并通过RBD结构域结合微丝并保护微丝免受UNC-60A/cofilin的降解，C-端结构介导的RTKN-1寡聚化对微丝保护功能至关重要。RTKN-1 C-端proline-rich motif介导RTKN-1与SDPN-1/syndapin之间的蛋白质互作，且SDPN-1缺失后导致RTKN-1的胞内分布异常， 因此SDPN-1可能通过结合RTKN-1调控其正确的功能定位。
细胞通过内吞摄取胞外物质从而与外界进行物质能量摄取及信息传递[1]。内吞过程中，部分质膜包裹胞外物质形成内吞小泡进入到胞内，随之进入胞内的还有质膜磷脂组分及蛋白受体等[2]。循环运输可将部分内吞的受体及膜组分从胞内运回细胞质膜，维持膜组分的稳定组成并高效介导功能受体的循环利用[3, 4]。内吞循环运输过程受到精确调控，在细胞的多种生物学过程中发挥了重要作用，其中包括信号传导、细胞分裂、细胞迁移、免疫应答等，循环运输紊乱将导致癌症、II型糖尿病及神经退行性疾病的发生[5-8]。
微丝网络在细胞内以一种高度动态的状态存在，微丝的聚合、解聚及重构为膜运输提供运输轨道、动力及结构支撑[9, 10]。有文献报道annexin A2及 Spire1介导早期内吞体上actin的成核过程，随后在Arp2/3的作用下形成actin patch，可能参与了早期内吞体上膜形变及出芽过程[11]。另有研究发现在循环货物hTfR的氨基酸序列中加入泛素序列后，hTfR则进入降解途径，但在加入泛素序列的基础上再插入一段微丝结合序列，则可将hTfR从降解途径中挽救，使其返回循环运输通路。
此外，有研究发现内吞体上的管状微结构域的稳定性由局部的微丝维持，协助循环途径货物分选[12]。纯化的WASH能够激活Arp2/3的actin成核过程，并直接与脂质体结合，缺乏WASH后内吞体也出现大量延伸的管状内吞体，与dynamin缺失相似[13]。PTRN-1为微管负端稳定因子，定位于分选内吞体，能通过CH结构域结合CYK-1/formin并激活其微丝聚合活性，从而维持循环运输的运行[14]。综上所述，微丝骨架为膜运输提供动力及支撑作用，尤其在循环货物的分选过程中发挥重要功能。
鉴于微丝骨架与循环运输之间存在密切的功能联系，且其功能细节研究尚不全面，因此研究人员通过RNAi双重筛选希望寻找循环运输相关的微丝调控蛋白，以理解在循环运输不同步骤中微丝动态发挥的具体作用。研究人员分别以CIE循环货物hTAC及微丝骨架标记物Utrophin-CH为指标在线虫全基因组中进行RNAi筛选，发现了PTRN-1及RTKN-1/Rhotekin/RTKN等参与微丝及循环运输调控的候选蛋白。
其中，Rhotekin在哺乳动物中被发现为Rho效应因子，在多种类型癌症中检测到Rhotekin蛋白质表达量显著升高[15-19]。在胃癌组织中，RTKN表达量高于正常组织，且NF-κB信号通路被显著激活，细胞表现出较高的抗凋亡能力[16, 20]。在肺癌细胞系A549中，敲降RTKN导致细胞的生长受到影响，发生凋亡的细胞数量增多[17]。
线虫RTKN-1为哺乳动物Rhotekin同源物，其蛋白质结构包含N端RBD结构域，中间PH结构域及含有PRM（proline-rich motif）的C端组成。研究人员发现rtkn-1(ok1404)突变导致线虫肠细胞中循环运输货物显著累积于RAB-5标记的早期内吞体中，说明内吞循环运输发生紊乱。同时，微丝网络结构受到严重破坏。体外实验检测到RTKN-1通过RBD结构域结合微丝，但并不影响微丝的聚合、解聚及成束过程。由于动态成像结果显示微丝网络动态增加，研究者推测RTKN-1可能负调控微丝解聚过程。
与推论相符，实验结果显示在UNC-60A/cofilin介导的微丝解聚体系中添加RTKN-1后微丝解聚过程发生显著延缓。进一步研究发现，UNC-60A过表达后微丝骨架结构减少，且循环运输发生紊乱；在rtkn-1(ok1404)突变中进一步敲降UNC-60A，可明显恢复微丝结构，并有效缓解循环运输受阻现象，说明RTKN-1的循环调控作用依赖于其维持的微丝结构完整性。
RTKN-1主要定位于循环内吞体，敲降PI(4,5)P2合成相关激酶会导致RTKN-1标记的点网状结构减少。同时，RTKN-1 PH结构域特异性的与PI(4,5)P2标记物具有高水平共定位，因此研究人员认为RTKN-1的循环内吞体定位主要由其PH结构域对PI(4,5)P2的亲合性决定。RTKN-1通过其CT端与RBD结构域发生分子间互作可形成寡聚体，寡聚体形成缺失的RBD-PH片段虽能结合微丝，但不具备延缓UNC-60A介导的微丝解聚能力。因此，寡聚化在RTKN-1调控微丝的功能中很可能发挥了重要作用。
此外，实验结果发现RTKN-1与SDPN-1具有蛋白质相互作用，SDPN-1缺失后RTKN-1的胞内定位发生异常。综上所述，本研究发现SDPN-1协助RTKN-1定位到其正确的内吞体功能位置，RTKN-1可能以多聚体形式保护微丝免受UNC-60A介导的解聚作用，从而维持循环内吞体上微丝网络结构完整性，调控循环运输的有序运行。
华中科技大学基础医学院博士后严雁玲为该论文的第一作者，史岸冰教授为通讯作者，博士生刘帅、胡灿、谢超逸、赵琳玥协助完成了本研究的生物化学实验和转基因动物制备等工作。该研究工作得到了国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金“细胞器互作网络及其功能研究”重大研究计划、国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年项目的资助。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1083/jcb.202007149
参考文献
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