核糖体合成并经过翻译后修饰的肽（Ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides, RiPPs）是一类具有多种生物活性的天然产物，它们具有通用的生物合成逻辑，在核糖体上合成一段前体肽，随后由后修饰酶对前体肽进行翻译后修饰形成成熟的 RiPPs。目前报道的含有烯基硫醚环（2-Aminovinyl-cysteine，AviCys）结构的天然产物都属于 RiPPs 家族，并且都具有良好的抗肿瘤活性，因此近年来引起了越来越广泛的关注。

维里硫酰胺（Thioviridamides，TVAs）分子是其中的典型代表，具有良好的诱导细胞凋亡的活性。然而烯基硫醚环的形成机制一直是未知的，早期推测烯基硫醚环的形成可能需要羊毛硫氨酸合酶的参与，环化酶或者环化功能域催化巯基通过 Michael 加成反应与上游脱水氨基酸偶联形成羊毛硫环。

含有烯基硫醚环结构的天然产物（A），羊毛硫环形成和烯基硫醚环形成的分子机制

在这项研究中，研究人员首先通过异源表达 TVA 的生物合成基因簇随后发酵分离成功获取了新的 TVA 分子 TVA-YJ-1，证明 TVA 的生物合成基因簇足以负责 TVA 的生物合成。随后通过生物信息学分析，发现蛋白 TvaF 属于黄素依赖的同源寡聚半胱氨酸脱羧酶超家族蛋白（homo-oligomeric flavin-containing cysteine decarboxylases, HFCDs）。

这类蛋白在目前报道的含有烯基硫醚环结构天然产物的生物合成基因簇中都存在，二级结构预测发现蛋白 TvaD 属于磷酸裂解酶，TvaCE 分析发现都具有激酶功能域，但 TvaE 的磷酸化关键氨基酸残基都发生了突变。研究人员推测特殊烯基硫醚环的形成是由 TvaCDEF参与完成的，体内基因敲除实验进一步证实了上述推测。

在Streptomyces sp. NRRL S-87中 TVA 的生物合成基因簇以及推测的生物合成途径

为了进一步解析 TvaCDEF 的催化功能，研究人员首先将前体肽与蛋白 TvaCD 在大肠杆菌中进行共表达，以及点突变蛋白 TvaCD 关键氨基酸残基，成功解析了 TvaCD 的功能，TvaC 负责 Ser1 和 Thr8 的磷酸化，随后 TvaD 催化磷酸解离形成脱水氨基酸。接着，通过体内体外实验研究人员发现蛋白 TvaF 催化末端 Cys 发生氧化脱羧形成不稳定的烯基硫醇中间体，最后 TvaE 与 TvaF 形成复合物共同催化烯基硫醚环的形成。

根据上述实验结果，研究人员厘清了催化烯基硫醚形成的各个蛋白的功能，推测了烯基硫醚形成的酶学机制：TVA 中高效形成 AviCys 残基依赖于四种途径特异性翻译后修饰酶。磷酸转移酶 TvaC 和磷酸裂解酶 TvaD形成两组分复合物催化脱水氨基酸的形成。HFCD 折叠的黄素蛋白 TvaF 具有氧化脱羧活性，催化前体肽 C 端 Cys 残基形成烯基硫醇。具有激酶功能域的 TvaE 蛋白与 TvaF 形成二组分复合物共同催化巯基通过 Michael 加成反应形成烯基硫醚环。

有趣的是，该激酶同源物还可以协调 TvaCD 催化脱水氨基酸的形成，避免它们在底物中竞争，因此我们进一步假设 TvaCD 和 TvaEF 可能形成一种四组分超级复合物，协同催化形成 AviCys 残基，其中 TvaE 作为辅助蛋白起到增强环化效率的作用。

在TVA的生物合成过程中AviCys形成的推测的形成模型

尽管在生化分子机制上，TVA 分子烯基硫醚的形成典型羊毛硫肽羊毛硫氨酸的分子机制一致，但是却有完全不同的酶学催化机制，通过基因组挖掘研究人员发现更多的含有烯基硫醚环结构的天然产都具有类似的酶学组成。烯基硫醚环酶学机制的解析为其将来在肽类化合物的大环化和功能化的应用奠定了基础。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2020.12.016