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周鸣/颜宁课题组揭示脂肪合成关键酶DGAT1结构及催化机制
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三酰甘油酯（triacylglycerol， TAG）是生命体中主要的能量储存物质，其合成过程主要有两种路径：3-磷酸甘油路径以及单酰基甘油路径（1）。
两种合成路径的最终一步都是二酰甘油酯（diacylglycerol，DAG）的酰基化从而产生TAG，而这一过程是由二酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol-O-Acyltransferase, DGAT）催化完成（2）。
人体中有两种序列不同源的DGAT，DGAT1和DGAT2。 DGAT1 主要负责脂肪吸收及储存过程中TAG的合成，DGAT2则负责各组织及皮肤基本脂肪的平衡。 前期研究表明，DGAT1敲除的小鼠能保持正常的代谢，并且可以抵抗高脂肪饮食引起的肥胖，而DGAT2敲除的小鼠则由于皮肤脂肪的缺失在出生数小时内脱水死亡（3）。 因此，DGAT1被认为是重要的治疗肥胖及糖尿病的药物靶点（4）。
根据序列同源性，DGAT1属于跨膜O-酰基转移酶超家族（Membrane-bound O-acyltransferase superfamily, MBOATs）。
MBOATs 超家族是一类广泛存在于不同物种中的多次跨膜酰基转移酶，其成员包括：催化TAG合成的DGAT1（5），催化胆固醇酯化的ACAT（Acyl-CoA: cholesterol Acyltransferase ）（6），以及催化蛋白质脂修饰的PORCN（Porcupine）（7）等。
前期虽然有很多DGAT1功能相关的研究，但针对其多聚物分子结构、底物识别方式以及反应机理依旧没有明确的结论。
该工作利用单颗粒冷冻电镜技术，首次解析了分辨率为3.1Å人源DGAT1的同源二聚体结构，并结合酶活性实验，确定了酰基辅酶A（acyl-CoA）在DGAT1上的结合位点。
在体外过表达并纯化得到人源DGAT1后，研究人员发展了一种酶联反应测试：利用α-酮戊二酸脱氢酶（α-ketoglutarate dehydrogenase，αKDH）将DGAT1产生的CoA转化为琥珀酰-CoA，同时生成NADH。
因此通过NADH的荧光来间接测量DGAT1的活性。结果显示，纯化后的人源DGAT1保持较高活性。
结构显示，DGAT1单个DGAT1分子主要由9个跨膜α螺旋组成（transmembrane helix, TM）。
两个DGAT1分子形成同源二聚体，二聚体中心为TM1和N端无规则卷曲与另一个DGAT1分子之间形成紧密的相互作用，中间的空间由纯化所用的去垢剂和蛋白结合的脂质分子填充。
剩下的TM2-TM9以及胞内卷曲IL1/IL2在内质网膜中形成一个帐篷形状的结构，其中心有一个很大的疏水空腔。
因为此结构与其他MBOATs成员（DltB以及ACAT1）的结构有明显的共性，研究人员命名为MBOAT 结构（MBOAT fold），其中的空腔命名为反应室（reaction chamber）。
根据前期研究及序列保守性， DGAT1的活性中心H415/E416位于TM7中部，朝向反应室中。
反应室有两个开口：一个小的开口在反应室的底部TM7-TM8-IL2之间，另外一个大的开口在TM4-TM6-IL1之间，将反应室延伸向内质网膜中。
acyl-CoA结合于反应室小开口处，一直延伸到反应室内部。
CoA部分结合于开口处IL2以及TM8上的极性残基，CoA向内延伸至活性位点附近，acyl-CoA的脂肪链则结合于反应室内高度疏水的口袋中。
与acyl-CoA相互作用的多数残基在DGAT1中高度保守，并且突变后对DGAT1活性有显著影响。
之前被认为是acyl-CoA结合位点的N端卷曲（8）以及FYXDWWN结构域（9）则与acyl-CoA并无直接相互作用。
结构中虽然未确认DAG的结合位点，但研究人员在结构中发现，反应室大开口附近的残基多为非极性残基，且在大开口附近有类似脂肪链的分子结合。
因此推断DAG很可能从大开口进入反应室中，从而接近于活性中心H415/E416。
之后DAG的羟基被H415活化从而进攻acyl-CoA的硫醇基团，从而引起酰基转移反应的发生。
最终，生成的产物TAG同样通过反应室的大开口释放到内质网膜中。
综上，本研究中报道了首个人源DGAT1同源二聚体结构以及其底物acyl-CoA的结合位点，对于针对DGAT1靶点抑制剂开发有重要指导作用。
另外，DGAT1的结构也将为MBOATs超家族中其他成员的结构及功能研究提供重要的信息。
本文第一作者为贝勒医学院博士生王列，普林斯顿大学钱洪武博士、韩亦沫博士以及贝勒医学院的年寅博士为共同一作。
韩亦沫博士现为莱斯大学助理教授，年寅博士现为中科院昆明动物所研究人员。
贝勒医学院周鸣教授课题组利用晶体学、冷冻电镜、电生理等生物物理手段，致力于研究膜转运的分子生理学、通道与载体的结构及功能调控、脂代谢酶的结构与功能。
此外，普林斯顿大学颜宁教授课题组还在同期Nature中发表文章“Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1”。
本文第一作者为普林斯顿大学钱洪武博士，北大-清华生命科学联合中心赵馨、西湖大学鄢仁鸿为共同一作，钱洪武博士和颜宁教授为本文共同通讯作者。
该工作首次解析了分辨率为3.0Å和3.1 Å人源ACAT1的同源二聚体以及四聚体结构，并结合相关活性实验，确定了酰基辅酶A（acyl-CoA）在ACAT1上的结合位点以及底物识别的机理。
周鸣教授课题组合影，左起二为王列，左起四为周鸣教授
相关论文信息：
DOI：10.1038/s41586-020-2280-2
DOI：10.1038/s41586-020-2290-0
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