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如何从血液中找到癌症的蛛丝马迹?

已有 1283 次阅读 2021-7-2 17:03 |系统分类:科普集锦


1、认识血液、血浆和血清

血液是流动在人的血管和心脏中的一种红色不透明的黏稠液体,由血细胞45%和血浆55%组成。

血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。红细胞主要功能是运进氧气运出二氧化碳,白细胞的主要功能是杀灭细菌,抵御炎症,参与体内免疫发生过程,血小板主要在体内发挥止血功能红细胞平均寿命为120天,白细胞寿命为9—13天,血小板寿命为8—9天。一般情况下,每人每天都有40ml的血细胞衰老死亡。同时,也有相应数量的细胞新生。

血浆血液除去血细胞以后剩下的浆液部分。血浆功能主要为营养,运输脂类,缓冲,形成渗透压,参与免疫,参与凝血和抗凝血功能。血浆制备的过程是:采集血液样本,加入抗凝剂,血样采集后1h之内进行低温低速离心10min,上清即为血浆。

血清是血液不加抗凝剂凝固析出的淡黄色透明液体。血清制备的过程是:采集血液样本,不加抗凝剂,室温下静置自然凝集30~60min,待血液凝固后,4℃放置过夜,平衡后,低温低速离心10min (低温:4℃;低速:人血~2000rpm),上清即为血清。

 

2、什么是cfDNActDNA?

血液中含有遗传物质DNA,包括人的基因组DNA(主要在白细胞中),线粒体DNA(主要在红细胞和白细胞中)以及细胞降解释放到血浆中的DNA碎片,即cfDNA

cfDNA是英文Circulating free DNA Cell free DNA的缩写,又叫循环游离DNA或者细胞游离DNA,是人体释放到血浆中的降解的DNA片段。cfDNA在血浆和血清中都有存在,正常人体的cfDNA主要是通过细胞凋亡过程产生的小而均匀的185~200 bp小片段DNA。健康人外周血中cfDNA浓度大都小于100 ng/ml,平均值约为30 ng/ml。cfDNA存在于人体的各种体液中,随组织损伤、癌症和炎症反应等发生浓度变化。体内产生的cfDNA分子被迅速降解,半衰期不到1小时或更短。而在肿瘤患者体内,外周血cfDNA浓度可高达到1 000 ng/ml,平均值约为180 ng/ml。

ctDNA是肿瘤坏死的组织细胞由于非正常的凋亡过程,产生大小不同且大于200 bp的大片段DNA,携带了突变、插入、缺失、重排、拷贝数异常和/或甲基化等基因信息,这些信息为寻找癌症的蛛丝马迹提供了可能


3、cfDNA是如何产生的?

细胞凋亡或坏死导致的天然染色质几乎完全降解。裸露的DNA片段在细胞凋亡时就被细胞内的核酸酶降解掉了,而蛋白结合的DNA片段由于蛋白包被能免受核酸酶的降解而被释放到循环的血液中。经蛋白酶处理后,可从外周血浆中回收蛋白结合的DNA片段。在健康个体中,cfDNA主要来源于骨髓和淋巴细胞,但在某些疾病过程或生理条件下,可能存在来自一个或多个另外的组织的来源。

ctDNA是来源于肿瘤细胞的DNA,属于cfDNA的一种类型。虽然ctDNA所占cfDNA的比例波动范围很大,约0.01-90%,有研究表明半数以上的突变频率在0.4%以下,但实际上,大多数ctDNA在cfDNA中的占比约为0.2%。因此,ctDNA的检测需要灵敏度较高的技术。


4cfDNA的液体活检如何避免白细胞污染和核酸酶污染?

血液中含有血细胞和血浆。白细胞含有基因组DNA,血浆和血清含有cfDNA。检测ctDNA靶点必须在总cfDNA的背景中进行。为了防止人源基因组DNA的干扰,必须从全血样本中去除血细胞,保留血浆和cfDNA。因此,ctDNA一般从外周血血浆中提取。

1) 白细胞对ctDNA的污染问题

在用全血加工血浆的过程中,由于白细胞的破裂,人的基因组DNA从白细胞中逸出并混入血浆,血浆会因此受到基因组DNA的污染,导致ctDNA靶点的浓度下降和检测分辨率降低。

2) DNA酶对ctDNA的降解问题

血液样本中存在DNA水解酶,混入到DNA后,会导致DNA的降解。ctDNA的半衰期只有16min到2.5h,而且丰度很低,保存处理稍有不慎就会遭遇降解。因此,妥善保存和处理样本是确保DNA提取和检测取得成功的关键。


5、检测血液cfDNA时,如何防止cfDNA的降解?

肿瘤患者体内的肿瘤细胞数量远远低于正常细胞,cfDNA在血浆中的含量很低,而ctDNA仅占cfDNA0.1%~5%,且不同癌种,不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大,因此相比于组织检测,ctDNA的检测需要更高的灵敏度和特异性研究表明,cfDNA的半衰期仅有1-2小时,在外周血中处于一个动态的不断变化的过程。因此,收到用于cfDNA检测的全血样本时,最好是先提取。如果没法立刻提取,需要先将血浆离心出来,然后放到-80度存放。为了防止血液cfDNA的降解,市面上有种全血样品游离cfDNA保存管可以延长血液cfDNA的保存时间。cfDNA保存管可直接用于血样的采集与运输,并稳定其中的cfDNA,是由EDTA抗凝剂和特殊的保护剂组成,能够有效抑制血浆中的核酸酶,并避免血液有核细胞中基因组DNA的释放。

6、ctDNA检测技术主要有哪些?

由于血液中ctDNA含量低,而且容易降解,因此检测ctDNA需要采用灵敏度较高的技术。目前,比较适合ctDNA检测的技术有数字PCR技术和结合UMI的NGS技术,灵敏度分别可以达到0.01%和0.1%左右。另外还有BEAMing技术ARMS-PCR技术和TELQAS技术等。

7、什么是微滴式数字PCR技术?

微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理,即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后,逐个对每个微滴进行检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。与传统PCR相比微滴式数字PCR技术的优势在于不依赖Ct值或内参基因,即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。微滴式数字PCR技术适合于拷贝数变异研究、复杂来源样品中含量极低核酸分子的检测、NGS数据验证、NGS测序文库的鉴定、miRNA等差异微小的基因表达研究。

8、什么是BEAMing技术

这种方法是基于小珠(Bead)、乳浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性(Magnetic),这四个主要组分来构建的,所以被称作为BEAMing。结合数字PCR与流式技术,利用特异性PCR引物扩增目标突变区后,与磁珠(磁珠上固定有特异的PCR 引物)混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后,利用不同颜色的荧光探针结合磁珠上的PCR产物,发出红色或绿色荧光,再利用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。

BEAMing技术应用优势:(1)在常规实验室条件下,数以万计的DNA分子可以通过该种方法来进行评估。(2)特异的突变可以通过流式细胞仪进行分离筛选以备进一步分析和研究。(3BEAMing技术可以用来研究特定组织或者人群中罕见的突变,以及研究一般基因序列或转录的产物的变异。

9、什么是分子条形码测序技术(UMI-NGS)?
分子条形码又称分子标签Unique Molecular indentifier,UMI),它的原理就是给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列,经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。这样,根据不同的标签序列我们就可以区分不同来源的DNA模板,分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变,哪些是患者真正的携带的突变,从而提高检测灵敏度和特异性。

10、什么是实时荧光等位基因特异性扩增技术(ARMS-PCR)?

ARMS-PCR是一项在PCR基础上发展起来的新方法,通过PCR和凝胶电泳即可检测出DNA中各种点突变。ARMS-PCR的基本构思是设计2个ASO引物,使之与另一引物构成PCR反应体系。这2个引物与探针的ASO不同,等位基因特异性碱基不是位于ASO中间,而是置于引物的3′端。这种设计是基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点。引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基,若此碱基对形成错配,链延伸反应就会因3′,5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻,故此法又称扩增受阻突变体系(amplification refractory mutation system , ARMS)。

11、什么是靶标富集长探针定量放大信号法TELQAS?

TELQAS技术由EXACT SCIENCES公司开发用于低丰度血浆DNA的检测。首先,对亚硫酸盐转化的DNA进行有限循环(12个循环)的多重PCR扩增,然后将PCR产物用10mmol/L Tris-HCl和0.1mmol/L EDTA溶液稀释10倍,取10微升稀释后用于三重LQAS分析,对靶标定量,可在ABI7500DX设备上进行。

12、什么是肿瘤标志物?

肿瘤标物是指特征性存在于恶性肿瘤细胞,或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质,或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质,并能反映肿瘤发生、发展,监测肿瘤对治疗反应的一类物质。肿瘤标志物存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中,能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到。

①肿瘤细胞的代谢产物,如:糖酵解产物、组织多肽抗原、核酸分解产物。

②分化紊乱的细胞基因产物,如:异位的ACTH片段,甲胎蛋白、癌胚抗原、胎儿同工酶。

③肿瘤细胞坏死崩解释放进入血液循环的物质,主要是某些细胞骨架蛋白成分,如细胞角质素片段抗原21-1(Cyfra21-1),多胺类物质。

④肿瘤宿主细胞的细胞反应性产物,如:VCA-IgA、EA-IgA。


体检常见肿瘤标志物

常见的体检项目可分为如下几种:

①血清癌胚抗原(CEA):正常值小于等于3.45微克/升。最初在结肠癌患者中发现CEA升高,后来发现,在胃癌、尿道癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、膀胱癌和宫颈癌患者中,有30%的患者血CEA升高。

②甲胎蛋白(AFP):AFP是最早发现的肿瘤标志物,是诊断原发性肝癌的常用检查项目,约87%的原发性肝癌患者,AFP高达20微克/升以上。

③前列腺特异抗原(PSA):正常值小于4微克/升,在前列腺癌中阳性率高达30%~86%,其升高水平与肿瘤密切相关。

④绒毛膜促性腺激素(HCG):正常人血中浓度小于5微克/升,如患绒毛膜上皮癌,睾丸和卵巢的胚胎性恶性畸胎瘤者,HCG可升高,且血、尿中的HCG的含量多少与预后相关联。

13、什么是液体活检技术?

液体活检(liquid biopsy)是与传统的组织活检相对应的概念,是以血液等非固态生物组织为标本进行取样和分析的体外诊断技术。液体活检中的“液体”以血液为主,也包括粪便、尿液、唾液以及其他体液样品。液体活检最主要的应用场景是肿瘤的早期筛查、诊断、用药指导、监测、预后管理,以及无创产前检测,除此之外还包括肌肉骨骼系统和结缔组织疾病、传染病和寄生虫病等其他疾病。

在癌细胞破碎和死亡后,它们会释放出包含的内容,包括循环的肿瘤DNA(ctDNA)。剥离自正常细胞的碎片会被巨噬细胞等“清洁细胞”洗掉或毁掉,但由于肿瘤过大,并且它们的细胞繁殖过快,因此清理者无法将它们完全处理掉。对患有晚期癌症的患者而言,肿瘤可能是血流中循环DNA的主要来源,但一般而言,ctDNA仅占总数的1%,甚至少到0.01%。早期测序技术还无法探测到它。但过去10年间科学家发展出了更灵敏的技术,BEAMing技术,能在片刻间探测和量化ctDNA数量。

 

14、ctDNA对于寻找癌症有何临床价值?

循环肿瘤DNActDNA)作为一种新的肿瘤标志物,将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用,尤其对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤,可避免复杂的、具有创伤性的活检。随着基因测序的飞速发展,已能在血液中对其进行检测并计数。ctDNA基因测序对于发现早期或癌前阶段肿瘤踪迹具有重要意义,为肿瘤的治疗提供时机,基于ctDNA的超早期肿瘤基因检测将是未来肿瘤疾病预防、治疗的研究和发展方向。

在癌症发展、诊断和治疗的整个自然过程中,cfDNA分析在多处具有潜在的应用。目前正在开发用于筛查cfDNA中新生肿瘤证据的早期检测方法。通过能够在无症状人群中识别早期癌症的液体活检,可能在治愈可能性较大的阶段识别癌症。实施根治目的的手术之后,可以分析在术后数周内采集的术后血浆中的cfDNA,确定已知存在于患者切除肿瘤中的突变或其他改变是否持续存在。由于cfDNA的半衰期非常短(1小时或更短),因此如果有证据表明术后血浆cfDNA中持续存在来自肿瘤的突变,则提供了直接证据证明患者存在可能最终导致肿瘤复发的残留疾病。如果在术后不久检出cfDNA中的残留疾病,则可以根据复发风险对患者进行分层,并可能有机会通过早期干预采取挽救性治愈。在转移性疾病的背景下,cfDNA的临床测序可以识别可能采取靶向治疗的遗传改变,以选择精准疗法。cfDNA测序与肿瘤测序相比,可以识别出许多相同的靶变化,因此当肿瘤材料不足以用于临床测序时,这可能特别有用。研究已经提示,ctDNA水平与整体肿瘤负荷密切平行,可用作监测治疗应答和耐药性发展的准确方法。疾病进展时,cfDNA分析已被证明可有效识别导致耐药的新发基因改变,这可以指导随后的治疗选择。由于在获得性耐药的背景下可能存在广泛的肿瘤异质性,因此cfDNA分析可以识别不同肿瘤转移中存在的多个并存的耐药改变,而单个肿瘤活检无法检出这样的改变。




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