Ammunition2019的个人博客分享 http://blog.sciencenet.cn/u/Ammunition2019

博文

论文赏析:结直肠癌早期诊断 粪便DNA的SDC2甲基化检测技术及其临床评价

已有 3173 次阅读 2021-4-21 16:32 |个人分类:结直肠癌|系统分类:论文交流

image.png

结直肠癌早期诊断——粪便DNA的SDC2甲基化检测技术及其临床评价


一、引言

本研究的目的是开发一种基于粪便样本DNA的 SDC2甲基化检测技术,用于结直肠癌的早期诊断并对其临床价值进行评价。


二、方法

本方法以粪便为样本,提取DNA,经过亚硫酸盐处理后进行两轮PCR反应。第一轮PCR富集SDC2靶标(LTE),第二轮PCR对SDC2进行甲基化特异性PCR(qMSP)检测,合称为meSDC2 LTE-qMSP分析(线性靶向富集甲基化特异性实时定量PCR法)。


(一)研究设计、研究群体和临床研究程序

序号

步骤

内容

1

研究目的

评价粪便SDC2甲基化检测方法及其在肠癌诊断中的效果

2

临床设计

回顾性病例和前瞻性对照


审批程序

3

临床审批

医院机构审查委员会批准。

4

知情同意

受试者提供书面知情同意书。

5

临床注册

临床试验在网站http://www.clinaltrials.gov注册并获得注册号


样本设计

6

纳入标准

30-80岁的合格受试者

7

排除标准

既往有大肠癌病史、化疗或放疗史或信息不完整的受试者

8

采样方法

 

前瞻性对照样本:结肠镜肠道准备前1天(或更早)采集粪便样本

回顾性病例样本:确诊为结直肠癌和其他胃肠道癌症的患者,在手术治疗前一天(或更早)采集粪便样本

9

样品信息

年龄、性别、临床诊断、息肉数量和大小、组织学亚型和粪便样本收集日期。

11

评价指标  

meSDC2-LTE-qMSP结果、结肠镜检查结果和病理结果

12

病理分级

 

晚期腺瘤(AA,≥1.0 cm)、非晚期腺瘤(NA,<1.0 cm)、增生性或其他息肉(HOP)和无疾病迹象(NED,结肠镜检查阴性结果)

 

(二)粪便收集、DNA提取和亚硫酸氢盐处理

序号

步骤

内容

1

粪便取样

至少2g粪便

2

粪便DNA保护液

20毫升

3

粪便DNA提取

取 1~2 g粪便样品在粪便保存液中用多旋涡混合器混匀后,进行提取。

4

DNA浓度测定

使用Qubit ds DNA-BR分析试剂盒进行

5

DNA转化

使用EZ DNA甲基化转化试剂盒进行,转化后DNA立即用于PCR分析,或者在-20°C下保存

 

(三)meSDC2 LTE qMSP方法的性能测定

序号

步骤

备注

1

检测仪器

Rotor Gene Q PCR

2

性能指标

检测特异性,灵敏度,最低检测限,再现性、可重复性和批间差

3

检测限分析(LoD)

阴性DNA

收集20名健康个体的粪便,提取DNA,经LTE-qMSP检测证实为SDC2甲基化阴性

阳性DNA

HCT116细胞系基因组DNA(完全甲基化的人类基因组DNA)

阳性梯度DNA

在2.0μg 阴性粪便DNA中加入不同量(20、2、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01和0 ng)的阳性细胞系DNA

PCR检测

每种浓度DNA重复检测24次

计算检测限

24次重复中,95%为阳性所对应的浓度为检测限。

4

精确度评估(CV)

精确度

Ct值的变异系数 = 标准差(SD)/平均值

PCR模板

两种甲基化浓度的DNA(0.5 ng和0.1 ng)

再现性

每种浓度重复2次,2个地点,连续5天PCR测试

重复性

每种浓度重复2次,连续20天PCR测试

批间差

每种浓度重复2次,连续5天PCR测试

5

PCR特异性评估

模板

0.5 ng HCT116-DNA和20 ng SDC2甲基化阴性DNA,分别加入105至106个拷贝的白色念珠菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌,人类巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型和乙型肝炎病毒DNA。

特异性

对含有靶标的DNA出现扩增,其他不扩增

6

干扰物的影响评估

模板DNA

甲基化SDC2阳性+粪便阴性样品+ 23种潜在干扰物质(根据临床应用和饮食习惯选择)。

评估

评估干扰物对检测性能的影响

干扰物清单列于表1(略)

PCR方法评价依据:McEnroe RJ, Durham AP, Goldford MD, Kondratovich MV, Lababidi S, Magari R, et al. Evaluation of precision of quantitative measurement procedures; approved guideline-3rd Ed. 2014. pp. EP05–EPA3. [Google Scholar] [Ref list]

 


(四)PCR检测方法 —— meSDC2 LTE qMSP

步骤

内容

检测靶标

SDC2的甲基化

内控基因

COL2A1(以无CpG区域设计引物)

模板DNA

亚硫酸氢盐修饰的DNA

第一轮PCR体系

反应体系20μL:含2.0μg转化后的粪便DNA、SDC2和COL2A1引物对各50 nmol/L, 4μL 5x AptaTaq PCR主混合物。

第一轮PCR温度

95℃5min,95℃15s,60℃60s,循环35次

第二轮PCR体系

LTE后,将反应混合物体积扩大至40μL,包含8μL 5xAptaTaq   PCR主混合物、250 nmol/L SDC2甲基化特异性引物、125 nmol/L SDC2探针、125 nmol/L COL2A1探针、62.5 nmol/L COL2A1探针和250 nmol/L通用序列引物。

第二轮PCR温度

95°C 5 min,然后进行40次95°C 15 s和60°C 60 s的循环。

质量控制

内控基因HCT116,阴性对照(全基因组扩增的人类淋巴细胞DNA);阳性对照。

重复

2

控制标准

当COL2A1的Ct值≤31时,试验合格。如果未检测到COL2A1或其Ct值大于31,则需要重新测试。

阳性截断值

Ct值<40

结果判定

2次重复只要有一个为阳性,样本就判为阳性;两次重复都为阴性则判为阴性。

 

(五)统计分析



样本量计算

PASS 13.0程序(NCSS,美国):结直肠癌患者241例,NED患者241例

样本设计

268名大肠癌患者、268名NED受试者(预计样本丢失率为10%)、结直肠息肉(n=67)、胃癌(n=23)和肝癌(n=12)患者

样本量估计无效假设

(I)敏感性高于70%;(ii)特异性高于80%。第一类错误单尾概率为0.025,保证每增加10%的检出率,效能不低于90%。

敏感性和特异性

设甲基化阳性为“1”,甲基化阴性为“0”,肠镜结果为金标准。

敏感度(%)=真阳性/RCC患者总数×100

特异性(%)=真阴性/受试者总数×100

性能参数

ROC曲线下面积AUC值及其95%可信区间(CI)。

统计分析

SAS V9.4软件完成

 

(六)样本入组流程图


 image.png

三、结果

meSDC2 LTE-qMSP 方法的测试性能

表 2以甲基化阳性细胞系HCT116为样本检测SDC2甲基化的最低检出限估计

image.png

甲基化浓度0.01%时 (相当于 3个体细胞基因组,即10 pg),从24次重复检测中出现13次阳性,阳性率54.2%(平均Ct值=30.39),说明此浓度低于检出限。甲基化浓度0.05%时 (50pg),阳性率 95.8% (23/24) (平均Ct值=28.62)。分析显示,95% LoD检出限是 34.5 pg (95% CI 18.6–64.1 pg),即20个体细胞基因组,相当于0.104% (图. 2)

image.png 

图2检测限分析(数据来自表2,分析采用Probit法进行)。Y轴是SDC2甲基化阳性率,而X轴是甲基化浓度(在总共2.0μg SDC2甲基化阴性粪便基因组DNA中添加HCT116基因组DNA)。箭头表示检出限LoD值=34.5 pg。

 

表3 PCR检测方法精密度分析结果

image.png

 

 不同研究群体的甲基化水平比较

image.png

图3是两次反应的粪便DNA SDC2甲基化分析结果


SDC2甲基化的分布:每个样本的甲基化水平用40-Ct表示。如果检测不到SDC2甲基化信号,则记为0。CRC表示结直肠癌(0-IV期)、HOP表示增生性或其他息肉、NA表示非进展性腺瘤(<1.0 cm)、AA表示进展性腺瘤(≥1.0 cm)、GC=胃癌、LC=肝癌、NED=无疾病证据

表4本研究评估过的人口学特征一览表

image.png

表5不同类型患者粪便DNA的SDC2甲基化阳性率

image.png

 

粪便DNA-PCR技术的临床评价

在结直肠癌和腺瘤患者粪便样本中, SDC2异常甲基化的频率和水平均高于NED患者(图3)。根据试验结果和ROC曲线分析,阳性截断值定为Ct=40(图4a),此时,总体敏感性为90.2%,AUC为0.902。 癌症分期、肿瘤部位、性别或年龄,敏感性无显著差异(P>0.05)。进展性和非进展性腺瘤的检出率分别为66.7%(2/3)和24.4%(10/41)。

对于增生或其他息肉(<1.0cm),SDC2甲基化的检出率为26.3%(5/19),与非进展性腺瘤的检出率相似。胃癌和肝癌的SDC2甲基化检出率分别为30.4%(7/23)和30(3/10)(表4)。对于245名结肠镜检查结果完全阴性的受试者,特异性为90.2%(图4b)。

image.png

图4A. 癌症与对照的ROC分析图,B. 肠癌分期对应的阳性率及其敏感性

 

粪便含有脱落的上皮细胞、食物和细菌以及各种PCR抑制剂,导致粪便样本DNA很难进行PCR扩增。为了提高PCR检测敏感性,本研究采取两步PCR扩增法,建立了粪便DNA的meSDC2 LTE qMSP方法[Clin Epigenetics. 2017 Dec 4;9:126. doi: 10.1186/s13148-017-0426-3. eCollection 2017],每个样本重复检测两次以提高检测敏感性(如果受试者的两个PCR反应中至少有一个呈阳性,则该试验被视为阳性)。据此,meSDC2 LTE qMSP试验对结直肠癌(0–IV)的总敏感性为90.2%,特异性为90.2%。大肠癌早期和晚期的敏感性无显著性差异。对于胃癌患者, SDC2甲基化检出率为30.4%。

 

文献来源

Yoon Dae Han,1 Tae Jeong Oh,2 Tae-Ha Chung,3 Hui Won Jang,3 Youn Nam Kim,4 Sungwhan An,2 and Nam Kyu Kimcorresponding author1Early detection of colorectal cancer based on presence of methylated syndecan-2 (SDC2) in stool DNAClin Epigenetics. 2019; 11: 51. doi: 10.1186/s13148-019-0642-0






http://wap.sciencenet.cn/blog-3419762-1283087.html

上一篇:论文赏析:DNA甲基化和影像学特征相结合的肺部结节恶性诊断模型
下一篇:论文赏析:结直肠癌甲基化标志物SDC2的全基因组鉴定与评价

0

该博文允许注册用户评论 请点击登录 评论 (0 个评论)

数据加载中...

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )

GMT+8, 2021-11-27 17:50

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007- 中国科学报社

返回顶部