ZmFBL41的自然变异赋予玉米纹枯病抗性

题目：Natural variation in ZmFBL41 confers banded leaf and sheath blight resistance in maize

期刊：Nature Genetics

作者及第一单位：Ning Li, et al, Zhaohui Chu (山东农业大学)

DOI：https://doi.org/10.1038/s41588-019-0503-y

研究背景

玉米纹枯病是由坏死性真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)所引起的重要病害。研究表明纹枯病抗性是由多基因控制的数量性状，且未发现有主效基因存在。目前，虽然有很多抗性相关的QTLs和防御相关的基因被鉴定，但是对立枯丝核菌病原菌的认识较少，且玉米和水稻抗纹枯病的机理尚不清楚。

材料和方法

材料：318份自交系群体（133份热带/亚热带起源自交系、78份温带起源自交系和71份混合起源自交系）

处理方式及性状鉴定：随机选取10株接纹枯病病原菌，5天后测量病变长度

研究结果

1、 玉米自交系纹枯病抗性的GWAS分析

自然变异群体中的病变长度出现差异，且热带/亚热带起源自交系的更强的纹枯病抗性。利用542438个SNP进行纹枯病抗性的GWAS分析，鉴定到28个纹枯病抗性关联SNP，这些SNP对应9个位于1、4、7和8号染色体的基因座。

(a)    不同自交系群体在接种纹枯病后的病变长度 (b) 不同起源的自交系群体的病变长度

(a) GWAS的曼哈顿图 (b) ZmFBL41区域的局部曼哈顿图

关联最显著的SNP位于4号染色体GRMZM2G109140的第二外显子，GRMZM2G109140为假定的分子量为41KDa的F-Box蛋白，命名为ZmFBL41。ZmFBL41定位在细胞质。对23个抗性自交系（RH）和28个敏感自交系（SH）的ZmFBL41测序发现，4个位于ZmFBL41第二外显子的SNP与纹枯病抗性连锁。

51个自交系可以分为两个单倍型：ZmFBL41^B73和ZmFBL41^Chang7-2，且ZmFBL41^B73和纹枯病敏感型呈线性相关。对20个SH和17个RH的表达检测发现，RH和SH之间的表达量差异不显著，表明ZmFBL41 的单倍型的抗病和感病与表达量无关。

(a)基于ZmFBL41的连锁作图和不平衡分析 (b)玉米自然变异群体的单倍型 (c)抗性自交系和感性自交系的ZmFBL41的表达分析比对

2、 ZmFBL41^B73是玉米纹枯病的负调控因子

转座子插入突变体Zmfbl41中的ZmFBL41表达量下降，且抗病能力增强，抗病相关基因ZmPR4和ZmPR10的表达量升高。在水稻中异源过表达ZmFBL41^B73的抗病能力下降，抗病相关基因ZmPR4和ZmPR10的表达量降低。

(a)转座子插入突变体Zmfbl41的纹枯病抗性鉴定 (b) 转座子插入突变体Zmfbl41的抗性基因表达 (c)水稻异源过表达ZmFBL41^B73植株对纹枯病敏感

3、 ZmFBL41^B73与ZmCAD互作，促进ZmCAD的泛素化降解

利用无细胞翻译系统检测细胞提取物中ZmCAD的降解程度，发现ZmCAD蛋白能够被ZmFBL41^B73介导的26S蛋白酶体降解。当蛋白酶体的活性被抑制时，ZmCAD蛋白更加稳定，且ZmCAD蛋白的降解部分依赖于ZmFBL41^B73。

(a、b、c) ZmFBL41^B7通过LRR结构域与ZmCAD 互作 (d) ZmCAD 的降解依赖于26S蛋白酶体(无细胞降解实验) (e) zmfbl41突变体的细胞提取物的降解速度更慢 (f) MG132处理抑制ZmFBL41^B37诱导的ZmCAD降解。

4、 ZmCAD通过调控木质素合成途径正调控作玉米纹枯病抗性

玉米转座子插入突变体zmcad的纹枯病抗性降低，且相关基因ZmPR4和ZmPR10的表达量降低。水稻ZmCAD同源基因OsCAD8B敲除株系的株高降低，木质素含量下降，抗纹枯病能力下降。这表明ZmCAD和OsCAD8B时纹枯病抗性的正调控因子。

通过测量10个抗病自交系和12个敏感性自交系侵染48h后的木质素含量发现，木质素在所有自交系中均先上升后降低，但抗病自交系的木质素含量更高。此外，zmfbl41和zmcad 突变体的木质素低于野生型。敲除ZmCAD后木质素合成途径并没有完全阻断，且玉米中存在12个CAD基因，CADs之间这表明可能存在功能冗余。

(a)    zmcad 转座子插入突变体的抗病能力下降 (b) zmcad 转座子插入突变体抗性相关基因表达降低 (c) OsCAD8B 敲除株的抗病能力下降 (d) 10个抗病自交系和12个敏感性自交系的木质素含量。(e), zmfbl41和zmcad 突变体的木质素含量测定。

5、 ZmFBL41^B73的自然变异阻碍ZmFBL41^B73与ZmCAD的互作

通过点突变获得ZmFBL41^B73LRR(E214G),ZmFBL41^B73LRR(S217R)和ZmFBL41^B73LRR (E214G/S217R)突变体，用Y2H验证是否与ZmCAD互作。ZmFBL41^B73LRR(E214G) 和ZmFBL41^B73LRR(S217R)仍然与ZmCAD互作，但ZmFBL41^B73LRR(E214G/S217R) 和ZmFBL41^Chang7-2LRR不能与ZmCAD互作。这表明LRR结构域突变能妨碍ZmFBL41^Chang7-2和ZmCAD互作。

玉米细胞提取物的降解实验和烟草瞬时表达系统降解实验表明ZmFBL41^Chang7-2由于LRR结构域的E214和S217突变导致不能与ZmCAD互作，ZmCAD积累。

(a) LRR结构域突变阻碍ZmFBL41^Chang7-2和ZmCAD互作。 (b) ZmFBL41^Chang7-2细胞提取物中ZmCAD的稳定性 (c) ZmFBL41^Chang7-2不能促进ZmCAD的降解 (d) ZmFBL41^B37的单个氨基酸替换不影响ZmCAD的降解

小结

敏感型玉米品种在纹枯病菌侵染早期，ZmFBL41与SKP1互作形成SCF^FBL41 复合体，招募ZmCAD蛋白被26S泛素化降解，ZmCAD蛋白含量降低，使得木质素合成减少，细胞壁防御强度下降，最终被纹枯病菌侵染。而抗性品种中ZmCAD蛋白不能与复合体互作使得抗纹枯病能力增强。

问题：

1、  木质素含量是否可以作为纹枯病抗性的生物标记，若不能，该如何寻找？

2、  突变敏感型品种的ZmFBL41或者过表达ZmCAD 基因是否会增加植物在正常条件下的能量损耗，从而影响作物的正常生长或者产量？

3、  作者推测CAD家族成员存在功能冗余，是否真的存在该现象，若有，该如何鉴定？若没有，是否存在其他互补途径？

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