外泌体 (exosomes) 是由哺乳动物细胞通过“内吞-融合-外排”等机制，主动向胞外释放的纳米级 (直径40~60 nm) 双层囊泡小体，携带蛋白质、核酸、脂质等多种生物活性分子。越来越多的证据表明，外泌体是细胞间交流的重要媒介，它们可以将功能性分子转移到受体细胞中，或参与受体细胞膜受体介导的信号传导 。此外，由于外泌体在体液中很容易获得，常作为非侵入性液体活检的重要内容，以帮助识别疾病和评估治疗反应。而外泌体的天然分子转运特性以及良好的生物相容性，也令其在药物载体、递送、治疗等领域存在巨大应用潜力。

研究人员首先从14种细胞系中通过普通超速离心 (UC) 分离得到外泌体，这些细胞系包括：良性上皮细胞 (HEK293T, HPDE, HPNE, MCF10A)、恶性上皮细胞 (BxPC3, PANC-1, MCF7, MDA-MB-231)、间充质细胞 (BJ, mCAF, PSCs)、T淋巴细胞 (Jurkat)、B淋巴细胞 (Raji)、单核细胞 (THP-1)。随后，利用流式细胞技术，检测不同细胞外泌体传统标志物CD9/CD63/CD81的表达情况，结果表明，这些四次穿膜蛋白并未表达于所有类型细胞外泌体中。比如，HPNE, Jurkat, Raji中未检测到CD9；BxPC3中不存在CD81。这一结果也促使研究人员进一步寻找不同来源外泌体中普遍存在的蛋白质标志物。

图1 CD9, CD63, CD81在不同细胞外泌体中的表达情况

随后，研究人员使用super-SILAC (细胞培养条件下稳定同位素标记) 联合高分辨率质谱技术对14种细胞系外泌体蛋白质进行全面定量分析 (图2a)，最多定量检测到2,500种蛋白质 (图2b)，其中1,243个蛋白质普遍存在于所有细胞系外泌体中 (图2c)。PPI分析发现这1,243个蛋白质间大多存在相互作用 (图2d)。GO富集分析则表明，这些蛋白质功能主要与膜泡，核酸结合，新陈代谢和胞内运输等功能有关 (图2e)，其中，90%的蛋白质与ExoCarta数据库中人源蛋白质一致 (图2f)。基于这些蛋白质的表达丰度，研究人员进一步分析得到了28个高丰度蛋白质以及21个低丰度蛋白质，他们分别可以作为潜在的外泌体识别、排除标志物。

考虑到分离方法对外泌体纯度和得率影响较大，因此，研究人员在此前UC方法的基础上，还利用密度梯度超速离心 (OptiPrep-based DG) 和尺寸排阻色谱 (SEC) 从HEK293T、MDA-MB-231、PANC-1三种细胞系中分离外泌体进行蛋白质组检测 (图3a)，最多定量检测到约2,600个蛋白质 (图3b)，约70%的蛋白质可以在三种不同分离方法得到的外泌体中重复鉴定到 (图3d)，表明每种分离方法都能识别出大部分的外泌体蛋白质。主成分分析显示，生物学重复间的外泌体蛋白质组高度相似，且不同类型细胞间的外泌体蛋白质差异度明显大于分离方法产生的差异 (图3e)。而对于此前鉴定到的1,243个外泌体中普遍存在的蛋白质，研究人员发现有1,212个存在于DG、SEC分离得到的外泌体中。类似地，前期得到的外泌体识别、排除标志物也进一步分别缩减至22个和15个。

在所有22个潜在的外泌体识别标志物中，Syntenin-1 (SDCBP) 始终是丰度最高的蛋白质 (图4a)，western blot结果的确发现Syntenin-1存在于各种细胞系外泌体中 (图4b)，以及不同分离方式得到的外泌体中 (图4d, e)。为了进一步验证Syntenin-1作为外泌体标志物的普适性，研究人员从三种细胞系中分离得到了凋亡小体、细胞微泡、外泌体，发现Syntenin-1仅存在与外泌体中 (图4f)。而在人血浆、尿液以及其他哺乳动物细胞系、血清样本中，Syntenin-1均表达于外泌体中。

总的来说，此项研究通过检测多种细胞系外泌体蛋白质组，提供了外泌体全面定量蛋白质图谱，在此基础上，细致地评估了常见外泌体分离方式对蛋白质鉴定结果的影响，证明CD9/CD63/CD81实际上并不能作为外泌体的通用标志物，而Syntenin-1则无一例外地存在于不同物种、不同样本来源的外泌体中，突出了Syntenin-1作为外泌体生物标志物的重要意义。

1, Fernanda G Kugeratski, et al. 2021. Quantitative proteomics identifies the core proteome of exosomes with syntenin-1 as the highest abundant protein and a putative universal biomarker. Nat Cell Biol.