撰稿人：张媛媛（华中科技大学）

精读文献标题：Proteomic analysis of circulating extracellular vesicles identifies potential markers of breast cancer progression, recurrence, and response（循环细胞外囊泡的蛋白质组分析鉴定乳腺癌进展、复发和反应的潜在标志物）

发表时间：2020年10月2日

发表期刊：Science Advances

影响因子：13.116

作者及单位：来自以色列的研究人员

主要结论：强调了细胞外囊泡（sEV）蛋白质组分析的预测能力及其对乳腺癌诊断和治疗的潜力。该分离和分析方法可能成为用于确定治疗方案以及应对治疗反应的新工具。

文献精读

乳腺癌（BC）的早期诊断对于肿瘤治疗和生存率有重要的临床影响。当前主要的筛查方法有乳房X光检查、超声和核共振成像，但是这些影像学方法存在一定的生物危险性以及价格昂贵等缺点。随着蛋白质组学技术的发展，从BC患者血浆中提取的循环细胞外囊泡（EV）进行蛋白组学分析，可作为一种重要的影像学方法补充，在肿瘤的早期发现、诊断和预后中存在广阔的应用前景。

近日，以色列的科学家们在国际期刊Science Advances（IF=13.116）上发表了一篇关于利用循环细胞外囊泡的蛋白质组分析确定乳腺癌进展、复发和反应的潜在标志物的重要研究。研究人员通过一种低价、高效的方法从BC患者血浆中分离出小细胞外囊泡（sEVs），随后利用反向蛋白阵列（RPPA）对富集的sEVs进行蛋白质组学分析比对，发现了一些可用于区分BC患者和健康人的特征蛋白质，其中FAK和纤连蛋白表现出较高的诊断准确性。文章证明了sEV蛋白组可在预测BC复发风险方面扮演着极其重要的角色，具有巨大的临床潜力。

1、人血浆中sEVs的分离及其蛋白质组学分析

研究人员首先结合分子排阻（SEC）和过滤的方法从血浆中高效分离出sEVs，仅需2 mL血浆即可得到高纯度的sEVs。相较于其他方法，SEC可以保持sEVs的完整性同时减少血浆蛋白污染。

接下来，研究者对提取的sEVs蛋白质进行了RPPA分析，得到大约276种与信号通路相关的蛋白质，通过术前BC样本和健康组对比发现，FAK、MEK1和纤连蛋白显著上调。使用k最近邻算法（k-Nearest neighbor, kNN），以留一法交叉验证和ROC-AUC作为结果评估，得出在BC病人中5种蛋白上调、5种蛋白下调，这些差异表达的蛋白质可以用作区分BC和健康组的生物标签，具有极高的灵敏度和较好的特异性。随后利用弹性网络回归法进行进一步验证分析，发现10种差异表达的蛋白中有7种仍可以作为有力的预测标签，并具有更高的特异性。对其中表达上调的蛋白进行ROC曲线分析发现FAK可作为最有力的预测标签。

图1  从人体血浆样本中提取sEV流程图（左）；sEVs富集分数的RPPA分析（右）

2、乳腺癌不同阶段的生物标签的鉴定

研究者又对BC不同阶段之间的显著差异进行了研究。将BC阶段划分为Ⅰ期和ⅡA期，其中Ⅰ期sEVs颗粒大小和健康组并无显著差异，而ⅡA期sEVs颗粒表现出向较小转变的趋势，且其数量显著增加。为了寻找能区分Ⅰ期、ⅡA期和健康样本的sEV标签蛋白，研究者使用kNN及ROC-AUC分析，同样得出FAK、MEK1和纤连蛋白在Ⅰ期和ⅡA期中显著上调。表皮生长因子受体（EGFR）和P-钙粘蛋白可分别用于区分健康组和Ⅰ期、ⅡA期，而区分Ⅰ期和ⅡA期的标签蛋白为IGFRβ。其中P-钙粘蛋白和TAZ在ⅡA期中显著下调，与sEV数目呈显著负相关，这表明sEVs和特异性蛋白表达水平有助于区分Ⅰ期和ⅡA期患者。

图2  不同BC阶段的EV数量和蛋白质含量

3、复发风险的蛋白质标签

研究人员对复发病人样本进行RPPA分析发现，术前样品具有高度差异性，因此可以通过鉴定一个标签蛋白来预测复发的可能性。基于21个所选基因的RNA表达水平的肿瘤复发风险评分是一种评估BC患者复发可能性和化疗益处的优秀临床试验。高肿瘤复发风险评分预示着较高的复发风险，而将蛋白质组学分析与肿瘤复发风险评分相结合可以显著提高预测能力。通过比较3个复发病人的RPPA数据，观察到HSP70表达最为显著，表达量最高，与之前文献报道其与肿瘤复发相关的结论相一致。此外，还发现几种差异表达的蛋白与肿瘤复发风险评分具有良好的相关性，这些发现证实了sEVs蛋白质组学分析可用于预测复发风险方面。

图3  复发预测及相关蛋白标志物

4、术后EVs分析

研究者对27组术后病人的EVs进行分析，观察化疗和放疗过程中EVs的差异性。光散射分析表明，与术前病人和健康人对比，术后病人的直径约为150 nm的EVs颗粒有显著变化，同时在较小范围内sEVs的数量显著减少。接受化疗的患者的EVs在肿瘤转移中富集，转铁蛋白受体增加，同时E-钙粘蛋白表达显著下调，表明肿瘤在转移过程中可能发生上皮-间质转化。而在放疗过程中，超氧化物歧化酶2（SOD2）表达上调最为显著，可能是辐射诱导的活性氧生成和氧化应激所致。最后，比较术前和术后与健康样本的差异表达蛋白，包括上述BC的生物标志物FAK、MEK1和纤连蛋白，这些蛋白在术后样本的EV中仍保持表达上调，预示着这些蛋白可作为强有力的生物标签。

图4  术后样本分析

综上所述，本研究提出一种低成本、快速和可靠的方法从BC患者血浆中分离出sEVs，使用RPPA对富集的sEVs进行蛋白质组学分析，鉴定出7种可用于区分BC患者和健康人的特征蛋白质。在疾病晚期，sEVs的大小显著减少；P-钙粘蛋白和TAZ在健康人和BC ⅡA期患者中的表达有着显著的差异性，IGFRβ可作为Ⅰ期和ⅡA期的差异表达蛋白标签。此外，FAK和纤连蛋白均表现出较高的乳腺癌早期诊断的准确性。该研究强调了sEV蛋白组分析的预测能力及其对乳腺癌诊断和治疗的潜力，该分离和分析方法可能成为用于确定治疗方案以及应对治疗反应的新工具。