利用Biolog Eco板和PICRUSt2方法分析凡纳滨对虾养殖池塘末期细菌群落的功能多样性

Analysis of bacterial community functional diversity in late-stage shrimp  (Litopenaeus vannamei) ponds using Biolog EcoPlates and PICRUSt2

Aquaculture [IF: 4.24]

DOI：https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.737288

发表日期：2021-08-04

第一作者: Qiong Zhao(赵琼)^1,2

通讯作者：Qian Yang(杨谦)(yangq@hit.edu.cn)¹

合作作者: Fengxing Xie (谢凤行), Fengfeng Zhang (张峰峰), Ke Zhou (周可), Haibo Sun (孙海波), Yujie Zhao (赵玉洁)

主要单位：

¹哈尔滨工业大学生命科学与技术学院(School of Life Science and Technology, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China)

²天津市农业科学院农业资源与环境研究所(Tianjin Institute of Agriculture Resource and Environment, Tianjin Academy of Agriculture Science, Tianjin 300384, China)

摘要

微生物在环境中的作用是通过群落功能来实现的，但是人们对凡纳滨对虾池塘水体和底泥中微生物群落的功能多样性仍知之甚少，这限制了人们采用微生态策略进行对虾养殖的水质调节和疾病控制。本研究中，作者将高通量测序技术和Biolog Eco方法相结合，研究凡纳滨对虾池塘养殖末期水体和底泥中细菌群落的结构和功能多样性，并评价了基于Biolog Eco板的微生物群落实际代谢特性与基于PICRUSt2的预测功能的相关性。结果表明，水体和底泥中微生物群落呈现一定的代谢偏好，水体微生物群落倾向于利用羧酸类、高聚物类和碳水化合物类碳源，底泥微生物群落倾向于利用高聚物类和氨基酸类碳源；部分优势菌群(放线菌门、疣微菌门和厚壁菌门)与水体微生物群落的代谢特性正相关；水体和底泥中微生物群落的实际代谢特性与预测功能之间存在显著的相关性，但在level3水平就同一物质的代谢特性和预测功能没有表现出显著的相关性。该研究揭示了微生物群落呈现一定的代谢偏好，为养殖水体净化技术(例如生物絮凝技术)碳源的选择提供指导；找出了微生物群落代谢特性正相关的部分菌株，为养殖水体新型微生态制剂的研发提供参考。

引言

凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)作为世界产量最大的甲壳类水产品，2018年全世界总产量约497万吨，占到世界甲壳类水产品的52.9%。中国作为世界最大的水产养殖国，池塘养殖是中国凡纳滨对虾养殖的主要方式。然后由于养殖末期池塘内饵料和排泄物不断增多，水质恶化严重，往往导致病害频发，产量锐减。微生物作为生态系统的重要组成部分，其对环境的作用主要是通过群落代谢功能来实现的，因此全面掌握养殖池塘微生物群落的结构和功能是建立有效的微生态策略以保证对虾生产的前提。

凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)作为世界产量最大的甲壳类水产品，2018年全世界总产量约497万吨，占到世界甲壳类水产品的52.9%。中国作为世界最大的水产养殖国，池塘养殖是中国凡纳滨对虾养殖的主要方式。然后由于养殖末期池塘内饵料和排泄物不断增多，水质恶化严重，往往导致病害频发，产量锐减。微生物作为生态系统的重要组成部分，其对环境的作用主要是通过群落代谢功能来实现的，因此全面掌握养殖池塘微生物群落的结构和功能是建立有效的微生态策略以保证对虾生产的前提。

结果

水体和底泥中微生物群落的代谢功能多样性

Functional diversity of the microbial communities in the water samples and sediment

除了胺类物质的利用以外(WS1和WS2水样不利用胺类)，其他五种主要碳源都被水体和底泥微生物群落有效利用(图1A-F)。底泥微生物群落碳源利用的平均吸光值显著高于水体样品，底泥和水体样品微生物群落对碳源的利用表现处一定的协同，水体微生物群落的碳源利用率高，相应的底泥微生物群落的利用也高。水体样品更多的利用羧酸类(35.08%)，多聚物类(24.91%)和碳水化合物类碳源(23.16%)，底泥样品更倾向利用多聚物类(25.61%)和氨基酸类碳源(21.31%)(图1 G)。主成分分析显示水体和底泥对六类碳源的利用存在显著差异(图1 H)。热图分析表明底泥微生物群落偏好的碳源包括吐温80，吐温40， L-天冬氨酸, γ-羟基丁酸, L-苯基丙氨酸等，水体微生物群落偏好的碳源包括丙酮酸甲酯，N-乙酰-D-葡萄糖胺，衣康酸和纤维二糖等(图1I).

图1 基于Biolog Eco板的水样(WS1-WS3)和底泥(SD1-SD3)微生物群落的功能多样性

A-E 碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类、高聚物类、酚类和胺类碳源利用的平均吸光值;

G 不同类碳源利用的相对百分比;

H 碳源底物利用的主成分分析；

I 微生物群落对Biolog Eco板上31种底物利用的热图**。

水体和底泥微生物群落结构及与代谢特性的相关性分析

Microbial community structure in the water samples and sediment and its correlation with metabolic profiles

水体和底泥样品的微生物群落共注释了76个门，前10大优势门分别为变形菌门(Proteobacteria), 蓝藻门(Cyanobacteria), 放线菌门(Actinobacteria), 绿弯菌门(Chloroflexi), 疣微菌门(Verrucomicrobia), 拟杆菌门(Bacteroidetes), 广古菌门(Euryarchaeota), 浮霉菌门(Planctomycetes), 厚壁菌门(Firmicutes)和螺旋体门(Spirochaetes). 变形菌门(Proteobacteria，38.67%), 蓝藻门(Cyanobacteria，15.96%), 和放线菌门(Actinobacteria，16.48%) 是水体样品的3大优势门；变形菌门(Proteobacteria，40.96%), 绿弯菌门(Chloroflexi，11.79%),拟杆菌门(Bacteroidetes， 9.66%)是底泥样品的三大优势门(图2). 注释到298个科，伯克氏菌科(Burkholderiaceae), 未定名的蓝细菌科(unidentified_Cyanobacteria), Chthoniobacteraceae在水样种显著富集，嗜氢菌科(Hydrogenophilaceae), 厌氧绳菌科(Anaerolineaceae), 互营菌科(Syntrophaceae)在底泥中显著富集 。在属水平，未定名的蓝细菌属(unidentified_Cyanobacteria), Candidatus_Aquiluna, Polynucleobacter 和Acidibacter 在水体样品中显著富集；硫杆菌属(Thiobacillus), Smithella属和甲烷绳菌属(Methanolinea)在底泥中显著富集。

图2 水体(WS1-WS3)和底泥(SD1-SD3)中微生物群落在门水平的相对丰度

a 门水平相对丰度的主成分分析;

b 各样品前10种优势门的相对丰度;

c　优势门在水体和底泥样品中的差异检验扩展柱形图。

对水体和底泥中的优势菌群和微生物群落对Biolog Eco板上的碳源利用进行相关性分析(图3)。结果发现放线菌门(Actinobacteria)，疣微菌门(Verrucomicrobia)和厚壁菌门(Firmicutes)与水体微生物群落对碳源的利用正相关，浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝藻门(Cyanobacteria) 和酸杆菌门(Acidobacteria)与水体微生物群落对碳源的利用显著负相关。底泥样品中变形菌门(Proteobacteria)与底泥微生物群落对碳源的利用正相关，绿弯菌门(Chloroflexi)与底泥微生物群落对碳源的利用显著负相关。

图3 水体和底泥样品中微生物群落的优势门与基于Biolog Eco板的微生物群落各类碳源利用的相关性分析

A:水体，B：底泥。

微生物群落的预测功能

Predicted functional analysis of the microbial communities

采用PICRUSt2进行水样和底泥中微生物群落的功能预测(图4)。相比与样品的分类特性，所有样品的预测功能较为相似。排名前10位预测功能及其相对丰度范围分别是：全图概况 （39.73%~40.78 %）, 碳水化合物代谢( 8.31% ~8.98%), 氨基酸代谢(7.30%~7.76%), 能量代谢(4.63%~4.98%), 辅酶因子和维生素代谢(4.35 % ~4.54%), 转化( 2.71 % ~2.76%), 膜转运( 2.57 % ~3.27%), 信号转导(2.41 % ~2.70%)，复制与修复 (2.40 % ~2.76%) 和原核细胞群落(2.27 % ~2.69%)。在level 2水平的前20个预测功能中，水样微生物群落富集代谢途径(外源物质的降解代谢、氨基酸代谢、其他氨基酸代谢、脂肪代谢、萜类和聚酮化合物代谢、辅酶因子和维生素代谢)，环境信息加工(膜转运和信号转导)和细胞加工(原核细胞群落)等功能；底泥中富集9种预测功能，包括代谢途径(碳水化合物途径、核酸途径、多糖的生物合成和代谢、其他次级代谢物的生物合成和能量代谢)，基因信息加工(翻译、折叠，排序和降解，复制与修复)和细胞加工 (细胞移动和细胞生长与凋亡)。

图4 微生物群落的预测功能

a 水体样品(WS1-WS3)和底泥样品(SD1-SD3) 前20种level 2水平预测功能的相对丰度；

b 前20种level 2水平预测功能在水体和底泥样品中分布的差异分析。

群落预测功能与实际代谢特性的相关性分析

Correlation between the metabolic potential of the community at the
gene level and the actual metabolic profiles based in the Biolog EcoPlates

Mantel检测证实底泥微生物群落的代谢特性与level 1，level 2 and level 3水平的预测功能的相关性(R = 0.288, 0.3125, 0.3635; P = 0.0213, 0.0168, 0.0106)较水体样品(R = 0.102, 0.430, 0.489; P = 0.1024, 0.0008, 0.0002)低。图5展示了水样和底泥微生物群落基于Biolog Eco板的代谢特性和levle2水平前20种预测功能的相关性分析，其中碳水化合物代谢、萜类和聚酮化合物代谢、氨基酸代谢、脂类代谢、其他污染物的降解和代谢，以及复制和修复等预测功能与Biolog Eco板的碳源利用显著正相关，而辅酶因子和维生素代谢，折叠、排序和降解，能量代谢，其他氨基酸代谢和细胞移动等预测功能与Biolog Eco板的碳源利用显著负相关。底泥样品微生物群落的各预测功能包括外源物质降解和代谢、原核细胞群落、细胞移动和其他氨基酸代谢与Biolog Eco板的碳源利用显著正相关，而核酸代谢、次级代谢物的生物合成，复制和修复及翻译等预测功能与Biolog Eco板的碳源利用显著负相关。

图5 水体和底泥样品中微生物群落基于Biolog Eco板的代谢特性和微生物群落level2 水平预测功能的相关性分析

A:水体，B：底泥。

在level3水平，就同一物质的代谢特性和预测功能的相关分析如表1所示，除了糖原代谢和乳糖代谢外，没有显著的相关性被发现。

表1 基于Biolog Eco板的碳源利用与预测的相应物质代谢功能的相关性分析

结论

这项研究首次将Biolog Eco方法和高通量测序技术相结合研究了凡纳滨对虾池塘养殖末期微生物群落的实际代谢特性和预测功能，并深入探讨了他们之间的相关性。Biolog Eco方法表明微生物群落呈现一定的代谢偏好，对微生物群落代谢偏好的了解可以为养殖水体净化技术(例如生物絮凝技术)碳源的选择提供参考。部分种属与微生物群落的代谢特性正相关，下一步的研究中可选择正相关的菌属，如放线菌，考察其被用于养殖水体污染物降解的可能性。尽管目前研究越来愈多，但关于微生群群落实际的代谢功能和预测的代谢功能的关系仍然知之甚少。本研究发现凡纳滨对虾池塘微生物群落的实际代谢特性和预测功能存在显著的相关性，但在level3水平就同一物质的代谢特性和预测功能多数没有表现出显著的相关性。今后可采用宏基因组学和代谢组学进行更详细的分析，以解释微生物群落实际代谢功能和预测代谢功能之间的关系。这项研究样品量较小，主要涉及中国天津地区凡纳滨对虾精养池塘末期微生物群落的结构和代谢功能多样性。所观察到的微生物群落的功能多样性多大程度代表各类的凡纳滨对虾养殖池塘微生物群落，有待于进一步研究。

第一作者

第一作者：赵琼，天津市农业科学院农业资源与环境研究所高级工程师，哈尔滨工业大学同等学历博士研究生，主要关注水产养殖环境微生物群落结构与功能，水产微生态制剂的开发等。目前以第一作者发表了1篇Aquaculture、1篇Aquaculture International。

合作者 团队负责人：谢凤行，主要从事水体环境微生物生态、微生物多样性、水产微生态制剂等研究工作。目前在Bioresource Technology, Aquaculture, Aquaculture International期刊发表论文4篇。

通讯作者简介

杨谦， 博士、教授、生物医学仪器与工程博士生导师，微生物学硕士生导师，生物工程专业学科带头人。中国微生物学会常务理事，黑龙江省科协常务理事，黑龙江省微生物学会理事长，黑龙江省仿生与生物制造学会理事长，教育部生物技术与生物工程专业教学指导委员会委员，中国生物工程杂志专业评委、理事。1986年，赴英国里丁大学(Reading University)深造,先后攻读硕士、副博士、博士学位并做博士后研究。1991年回国以来，一直从事植物病理、植物病害生物防治、环境微生物、生物防治、微生物发酵工程、基因工程和基因组学等方面的教学科研工作。主持国家自然科学基金项目2项、国家教委资助项目2项、国家863项目2项、国家科技部支撑计划1项、省自然科学基金重点项目1项、省科技攻关重大项目2项、省科技攻关项目3项。先后在国内外发表文章280多篇(其中SCI源、EI源120多篇，Review of Plant Pathology 收录1篇，国际会议40多篇)；出版专著11部；获黑龙江省科技进步二等奖2项(核盘菌致病机理的宏观及微观研究、对杀菌剂抗药性基因转化利用的研究)、获黑龙江省科技发明二等奖1项(马铃薯薯渣液态发酵生产单细胞蛋白的工艺方法)、获黑龙江省自然科学二等奖1项(木霉菌和毛壳菌的基因工程及生物防治分子机理的研究)；申请国家发明专利20多项、获得证书10多项；主持研究的马铃薯淀粉工业副产物资源化关键核心技术—马铃薯薯渣液态发酵生产单细胞蛋白的工艺方法，具有完全自主知识产权，达到国际领先水平，于2020年完成生产示范，已经开始在我国马铃薯淀粉工业推广应用，这项技术在我国乃至全球马铃薯淀粉工业的应用将从根本上改变该工业污染大户的形象，在实现废弃物零排、大幅度减少CO₂排放的同时，大规模提高产业附加值，创造数千亿元产值；应邀出席国际会议15次，主持国际会议14次。

Reference

Qiong Zhao,Fengxing Xie,Fengfeng Zhang,Ke Zhou,Haibo Sun,Yujie Zhao & Qian Yang.Analysis of bacterial community functional diversity in late-stage shrimp (Litopenaeus vannamei) ponds using Biolog EcoPlates and PICRUSt2. Aquaculture(2021), doi: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.737288

Bioresource technology:天津资环所在高蛋白小球藻选育研究取得新进展 研究成果发表于一区Top期刊《Bioresource technology》 http://www.taas.ac.cn/c/2020-08-10/493126.shtml