损伤和微生物模式的共同作用控制着根部的局部免疫反应

Co-incidence of Damage and Microbial Patterns Controls Localized Immune Responses in Roots

Impact Factor：36.216

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.01.013

发表日期：2020-02-06

第一作者：Feng Zhou¹

通讯作者：Feng Zhou(feng.zhou@unil.ch)¹, Niko Geldner(Lead Contact)(niko.geldner@unil.ch)¹

合作作者：Aure′ lia Emonet,Vale′ rie De′ nervaud Tendon,Peter Marhavy,Dousheng Wu,Thomas Lahaye

主要单位：

¹瑞士洛桑大学植物分子生物学系(Department of Plant Molecular Biology, Biophore, UNIL-Sorge, University of Lausanne, 1015 Lausanne, Switzerland)

写在前面

分享标题：Cell：植物根系如何允许有益微生物定植的

关键字：拟南芥，根免疫力，微生物模式，模式识别受体，局部反应，损伤门控

点评：微生物相关分子模式（microbe-associated molecular patterns, MAMPs）的识别对于植物的免疫反应至关重要。如何将这种复杂的感知系统有效地部署在不断暴露于微生物的根中仍然是一个谜。本文通过分析拟南芥中单细胞分辨率下的MAMP受体表达和应答，观察到分化的外细胞层显示出模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs)的低表达并且缺乏MAMP应答。然而，这些细胞可以通过邻近细胞的损伤被门控以变得有反应。并且得知局部损伤也导致对原本非免疫原性的有益细菌的免疫反应。尽管土壤中存在微生物模式，本研究还发现，细胞损伤可以启动局部免疫反应，这将有助于从理论上提出如何利用MAMP。这些发现为非致病性微生物如何通过简单地避免损伤和随之而来的免疫反应的强烈增强，而成功地在根中定植提供了一个全新层次的解释。

图解摘要

根需要微生物分子模式和植物组织损伤来产生局部的抗菌免疫反应，展示了一种有效的方法来适当地对病原体作出反应，同时保留共生体。

Roots require both microbial molecular patterns and plant tissue damage in order to mount localized antibacterial immune responses, revealing an effective way to respond appropriately to pathogens while sparing commensals(In Brief)

亮点

• 拟南芥的根需要细胞损伤来产生强烈的局部免疫反应
• 受损细胞上调其邻居的模式识别受体表达
• 内胚层屏障将分化的细胞类型的免疫反应区分开
• 损伤门控可以最小化针对非致病性根部定殖者的免疫反应

总结

微生物相关分子模式（MAMPs）的识别对于植物的免疫反应至关重要。如何将这种复杂的感知系统有效地部署在不断暴露于微生物的根部仍然是一个谜。通过分析拟南芥中细胞分辨率下MAMP受体的表达和响应，我们观察到分化的外细胞层显示出模式识别受体(PRRs)低表达并且缺乏MAMP的响应。然而，这些细胞可以通过邻近细胞的损伤被门控以变得有反应。小细胞团簇的激光烧蚀会强烈上调其附近的PRR表达，升高的受体表达足以诱导非反应性细胞产生响应。最后，局部损伤也会导致对原本非免疫原性的有益细菌的免疫反应。损伤门控被受体过度表达所覆盖，从而拮抗定殖。我们的研究还发现，细胞损伤可以“启动”局部免疫反应，这将有助于概念化地说明如何使用MAMP感知，尽管土壤中存在微生物模式。

背景

已经确定了许多定义的分子模式和相应的受体，并显示出它们引起了一组保守的分子反应。但是，应该同样认识到共生或共生微生物的相同微生物模式。这在根部富含微生物的土壤环境中尤其明显，根的外层细胞没有类似于叶子那样的保护屏障。根微生物组研究的最新突破引起了人们的兴趣，即了解如何避免非病原性微生物对PRR的组成型激活，同时保持其防御作用。微生物相关分子模式(MAMP)感知的分子轮廓在能够定量、时间分辨的早期反应测量系统中得到了表征。在拟南芥中，叶盘活性氧（ROS）测定，磷酸化有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）印迹，定量PCR（qPCR）或全基因组转录谱分析成为流行的工具。尽管此类分析确定了PRR信号转导的分子成分，但它们无法实现有意义的空间分辨率，因为它们会平均整个器官的细胞反应。然而，实际的初始病原体/微生物接触仅限于少数细胞和细胞类型，并且这种高度相关的反应空间维度在很大程度上尚未得到解决。研究时，我们观察到单细胞和整个幼苗反应之间存在显着差异。根部具有自主的MAMP反应，而β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因(或称胼果体沉积)表明对高浓度细菌MAMP，flg22的反应是有限的，主要在根冠和根过渡/伸长区。但是，GUS报告基因检测具有破坏性，并且仍低于单细胞或组织分辨率。此外，这种空间受限的MAMP反应的原因以及其潜在的生物学相关性仍不清楚。

为了解决这些问题，我们基于融合到一个核定位信号(NLS-
3xmVENUS) 的三重mVENUS，结合了新近发布的荧光标记物系。这使得在体内和真正的细胞分辨率下分析MAMP反应成为可能。选择这些高度敏感的标记物可在转基因品系中和连续世代中获得良好的表达和稳定的响应。所选择的启动子是基于成熟和广泛使用的MAMP应答基因。PER5 (PEROXIDASE 5)是从公共数据库中选出的一种强而早的、在根内高度诱导的MAMP诱导基因。WRKY11(WRKY DNA-BINDING PROTEIN 11) 是WRKY转录因子家族的代表，被证明可以介导MAMP信号传导，并且本身就是早期反应基因。MYB51(MYB DOMAIN PROTEIN 51)被证明是由MAMPs转录调控的，并控制拟南芥主要防御代谢产物的产生。我们还生成了FRK1(FLG22-INDUCED RECEPTOR-LIKE KINASE 1)，一种功能未知的受体样蛋白，被证明是早期MAMP诱导的强转录本。

结果

flg22诱导的MAMP反应在拟南芥根中受到空间限制

flg22-Induced MAMP Responses Are Spatially Restricted in Arabidopsis Roots

在生成的四个MAMP标记中我们发现，尤其是PER5和FRK1，在刺激之前显示出非常低的背景，并且在刺激之后表现出良好的诱导性(图 1A–1C)。为了将信号精确分配给特定的细胞和细胞类型，我们生成了具有组成性表达，质膜靶向的红色荧光蛋白的双标记线(图 1D)。另外，用红色荧光细胞壁染色剂碘化丙啶(PI)进行复染。

图1 flg22诱导的MAMP反应在拟南芥根中受到空间限制

Flg22-Induced MAMP Responses Are Spatially Confined in Arabidopsis Roots

(A) 6天大的拟南芥根的不同发育区域示意图。对三个不同的区域成像：分生区(MZ)，伸长区(EZ)和分化区(DZ)。TZ表示过渡区。

(B) 一种代表MAMP启动子标记物系(pFRK1)在1 mM flg22处理6小时后的表达模式。图像对应于(A)中所示的区域。在细胞伸长开始后，总是在25个内胚层细胞的距离处拍摄分化区图像。在每种处理中，都将显示单个共焦部分（单个图像，左）和z堆栈的最大投影（最大z，右）。中部纵向和横向（xz）剖视图分别显示在顶部和底部。核定位的mVENUS信号（绿色）与碘化丙啶（PI，红色）共同显示。比例尺，50微米。

(C) 在flg22不存在（-）或存在（+）的情况下，四个MAMP标记的mVENUS信号强度的定量分析。RID，原始强度密度。单个图像中总荧光信号的RID是成像的每个区域中每个核信号的RID之和。每个细胞核的荧光信号的RID =细胞核的mVENUS信号区域的大小（像素数）细胞核的平均荧光强度。箱形图中心表示中位数(n = 12个根)。星号(**p < 0.001)表示由方差分析和Tukey’s检验分析得出的均数之间在统计学上差异显著。ns,不显著。

(D)侧根原基（LRP）形成过程中的MAMP反应。双标记线的8天龄幼苗的IV期侧根图像，除了MAMP响应（绿色）以外，还通过pUBQ10 :: RCI2A-tdTomato表达（红色）突出了所有根细胞的质膜。纵向（左图）和横向（右图）的最大投影如图所示。在横断面上，为了获得清晰的质膜轮廓，将单个红通道图像与绿色通道最大投影叠加。箭头指示具有MAMP标记物反应的细胞核。在正交视图中，出现的LRP的形状由虚线圆表示，在纵向的最大投影中，出现的位置由蓝色箭头表示。比例尺，50微米。

(E) 自发的，非诱导的细胞死亡（星号）会在邻近的皮质细胞层中引起flg22的反应（箭头）。PI染色突出显示受损的表皮细胞。比例尺，50微米。

使用这些标记，我们确认了即使在高剂量的flg22（1 mM）下，MAMP响应也仅限于根冠，过渡/延伸区，而在分化的根部中却没有或幅度较弱。flg22是一种细菌鞭毛蛋白肽片段，是植物中公认的诱导剂，被用作原型MAMP。分化的根缺乏应答不是由于肽渗透的问题，因为活性的、荧光标记的flg22 (TAMRAflg22)完全渗透了根，直到内胚层扩散屏障。因此，内胚层、皮层和表皮的响应缺失并不是因为MAMP的渗透受阻，而分化的中柱响应的缺失则可能是由于内胚层的扩散屏障。我们观察到的受空间限制的响应不仅出现在flg22上，因为其他的MAMPs，如nlp20或一种中链3-羟基脂肪酸(3-OH-C10:0)，表现出非常相似的反应模式。elf18是另一个特征明确的细菌MAMP，总体上对根部几乎没有反应，而真菌几丁质是唯一在分化区引起直接反应的MAMP。

我们的MAMP/flg22响应的高分辨率映射揭示了在分化根中衰减的MAMP响应的有趣的、空间受限的异常。第一个例外是出现的侧根，在那里邻近的皮层细胞被出现的原基推、分离、可能伤害，对MAMP处理反应强烈(图 1D, 1F)。我们观察到的第二个例外是flg22在邻近细胞发生偶发性细胞死亡的细胞中的响应性 (图 1E,1G)。因此，分化的根有能力对MAMPs作出反应，并且可以以高度局部化的方式诱导这种应答。

激光诱导的细胞消融引起根中局部MAMP的响应性

Laser-Induced Cell Ablation Causes Localized MAMP Responsiveness in Roots

MAMP反应性与邻近细胞死亡之间有趣的空间联系促使我们诱导出可再生的且精确的细胞损伤，并观察其对flg22反应性的影响。通过用脉冲红外激光烧蚀不同根细胞类型的小簇，我们观察到仅在紧邻的细胞层中flg22的响应能力大大增强(图 2A, 2B)。重要的是，单独消融不会或几乎不会导致MAMP标记基因的诱导，表明细胞损伤本身不足以诱导强烈的MAMP反应。单细胞烧蚀已经引起了flg22的反应，但是当更多的细胞烧蚀时，这种影响逐渐变得更加明显，这促使我们使用三四个细胞的烧蚀作为我们的标准。延时分析显示，最早观察到的反应发生在flg22处理后的4h，这导致我们将6h用于大多数处理。我们的标记线渗入到一个fls2突变体中，表明这些反应完全依赖于一个功能性fls2受体。有趣的是，我们观察到损伤诱导的方向性，向内的组织层通常响应最强。在表皮，皮层和内胚层消融后，中柱细胞对flg22的反应强烈，而表皮细胞的消融并未在表皮邻居中引起flg22反应(图 2A, 2B)。为了解释在表皮邻居中的缺乏反应，我们可以假设诱导需要机械刺激。突然的压力差只会在皮层中发生，而不会在消融后在表皮细胞中发生，因为表皮细胞不会受到上覆细胞的反压。另一种可能性也许是，感知到胞间连丝完整性的崩溃，并且在皮质和表皮间的胞间连丝连接的质量和程度存在差异。

图2 有限的细胞损伤导致根中局部MAMP的反应性

Restricted Cell Damage Causes Localized MAMP Responsiveness in Roots

(A) 在分化根中，不同细胞类型的激光消融仅在存在flg22 (+flg22, 1 mM, 6 h)的情况下诱导局部的FRK1反应，而不单独诱导(-flg22)。FRK1报告基因的核定位信号(绿色)，与质膜标记物共同显示(见图 1D)(红色)。在细胞伸长开始后，在25个内胚层细胞处拍摄图像。纵断面和横断面的最大投影分别显示在左侧和右侧面板上。白色星号表示激光烧蚀的细胞。箭头表示FRK1反应性核。RID，见图例图 1C。比例尺，50微米。

(B) （A）中所示的实验的量化。在没有(绿色)或存在(红色)flg22的情况下，激光消融后不同细胞类型的FRK1反应细胞数量的柱状散点图。每个圆代表一个单独的一个根的激光消融(n = 12根)。图中描绘了平均值和SD(误差条)。星号(p < 0.001)表示由方差分析和Tukey’s检验分析的均数差异有统计学上的显著性。ns,不显著。Ep,表皮;Co，皮质； En，内胚层； St，中柱。

(C) 表皮细胞的损伤仅在flg22为“次优”（低）水平（+ flg22、100 nM，6小时）时才诱导强烈而局部的FRK1和PER5反应，而不能单独诱导（-flg22）。FRK1和PER5报告基因的核定位信号（绿色）可以单独显示（底部，-PI），也可以与PI染色共同显示（上部，+ PI）。白色星号表示激光烧蚀的细胞。白色和蓝色箭头分别表示在皮层和表皮细胞中通过激光消融和直接低水平flg22（100 nM）处理产生的MAMP的反应核。激光消融和共聚焦图像是在细胞开始伸长后的两三个细胞上拍摄的。比例尺，50微米。

(D) 实验的RID量化如（C）所示。箱形图中心显示中位数(n = 12根)。RID,原始强度密度。不同的字母表示由方差分析和Tukey’s检验分析的均数差异(p < 0.001)有统计学上的显著性。

在分化区，即使在高水平的flg22 (1 mM)下，也没有损伤的MAMP响应性的缺失，这使得观察到损伤后MAMP响应性的增强非常明显，这导致了本质上类似开关的质的变化。然而，许多共生菌和根致病菌优先在根过渡/伸长区定殖，该区域对高剂量的flg22有直接反应，不需要损伤。然而，当我们使用100 nM的flg22时，在这个区域只看到了MAMP响应的微弱诱导(图 2C and 2D)。在这种欠佳刺激的情况下，表皮细胞损伤强烈增强了皮质细胞对flg22的反应，类似于分化区。因此，尽管在分化根中最容易观察到，但损伤诱导的MAMP响应的增强可能是根中普遍存在的现象。

DAMP的单独存在不足以诱导MAMP响应

Presence of DAMPs Alone Are Not Sufficient to Induce MAMP Responses

人们尚不十分了解邻近细胞如何感知细胞损伤，但据认为其中一个重要因素是损伤相关分子模式（DAMP）的释放，这种模式可能很丰富，但主要是胞质分子，例如三磷酸腺苷（ATP）， 或小肽，例如AtPEP1。在植物中，细胞壁分解产物，如半乳糖和纤维二糖也起着DAMP的作用。有趣的是，即使在高浓度下系统地应用，无论是单独或以鸡尾酒形式，DAMPs本身也不能诱导我们在实际细胞损伤时观察到强烈而一致的flg22反应性(图 3A和3B)。AtPEP1单独处理可以轻微诱导FRK1而不是PER5在中柱的响应性，但不能诱导任何MAMP在分化的外细胞层的响应性。这表明，对相邻细胞损伤的感知比简单的DAMPs的存在要复杂得多，其依赖于其他线索，可能是由于细胞解体而引起的离子和渗透压释放或机械应力。

图3 DAMP的单独存在不足以诱导MAMP响应

Presence of DAMPs Alone Are Not Sufficient to Induce MAMP Responses

(A和B) 用flg22和四种DAMPs组合处理的伸长区（EZ）和分化区（DZ）中FRK1（A）和PER5（B）标记的表达模式的代表性图片。6日龄的根分别用每一个DAMP单独处理或与flg22联合处理6小时。DAMPs鸡尾酒是所有四种测试的DAMPs的混合物。这些化学品用于以下浓度的处理： 1 uM flg22; 1 uM
AtPEP1; 100 uM eATP; 100 uM 纤维二糖;
50 ug/mL OGs。核定位的mVENUS信号（绿色）与PI复染（红色）共同显示。mVENUS信号的最大投影和在横断面上图像的叠加，如前所述。请注意，AtPEP1仅在某些分化的星形细胞中导致相对较弱的FRK1反应(对于PER5标记则不是这种情况)，而不是在实际细胞损伤后观察到的皮质或内胚层细胞中，并且DAMPs混合物而不是单个DAMP能够激活伸长区中较弱的PER5反应性。比例尺，50微米。

MAMP受体的表达是由细胞消融诱导的且足以引起反应性

MAMP Receptor Expression Is Induced by Cell Ablation and Is Sufficient to Induce Responsiveness

我们发现，在组成型UBIQUITIN 10启动子(pUBQ10)下表达MAMP受体FLS2足以使分化的外根细胞层对flg22产生应答 (图 4A)。这表明FLS2本身是限制分化的根细胞对flg22响应的能力的唯一成分，这意味着所有其它必需的下游成分(例如BRI1相关激酶[BAK1]，葡萄孢菌诱导的激酶[BIK1]，MAPK，WRKYs等。)都存在。这与早期在其他器官或物种中观察到的MAMP受体的异常表达相吻合。因此，我们还想在细胞损伤后以单细胞分辨率监测FLS2的表达。目前使用的FLS2启动子补充了FLS2，并与MAMP响应的空间模式大致匹配。但是，启动子的大小很小（小于1,000 bp），显示出重要的线间变异性，在某些情况下与MAMP的响应不匹配。因此，我们另外产生了更长的启动子系（pFLS2long），其显示出较小的变异性和平均模式，该模式与所述的flg22诱导的MAMP反应，即与新出现的侧根相邻的反应或对乙烯的反应的增强基本一致。来自这个更长的启动子片段的FLS2表达也补充了fls2背景中flg22响应的缺失。

图4 邻居细胞死亡诱导的局部FLS2表达

Localized FLS2 Expression Induced by Neighbor Cell Death

(A) FRK1和PER5标记（绿色）在有或没有flg22处理（1 mM，6小时）在pUBQ10 :: FLS2转基因背景的分化区（DZ）中的表达。标记线用PI（红色）复染。箭头表示MAMP反应性核。 比例尺，50微米。

(B) 激光消融不同类型的细胞（未进行flg22处理）会在6天大的分化根中诱导局部FLS2表达。FLS2启动子标记（绿色）的核定位mVENUS信号与质膜标记（红色）共同显示。如前所述进行图像叠加，并在细胞伸长开始后在25个内胚层细胞处拍照。星号表示激光消融的细胞，箭头表示fls2阳性的细胞核。 比例尺，50微米。

(C) 不同细胞类型中FLS2阳性细胞数量的量化被显示在(B)中。在没有(绿色)或存在(红色)flg22的情况下，激光消融后FRK1反应细胞数量的柱状散点图。每个圆表示单独的一个根的激光消融(n = 12根)。图中描绘了平均值和SD(误差条)。星号(p < 0.001)表示方差分析和Tukey s检验分析的均数之间有有统计上的显著差异。ns，不显著。 Ep，表皮； Co，皮质； En，内胚层； St,中柱。

(D) 在正交图中，在激光消融分化的表皮细胞后(使用或不使用flg22)，实时监测FLS2的诱导。星号和箭头分别表示激光消融的细胞和fls2阳性的细胞核。比例尺，50微米。

(E) 表皮细胞消融后fls2 -融合蛋白(FLS2-GFP)积累的正交图的最大投影。黄色箭头表示邻近皮层细胞中上调的FLS2-GFP荧光(fire LUT of ImageJ software)。白色星号表示激光烧蚀损伤的细胞.比例尺，50微米。

(F与G)细胞损伤激活了未分化区域的局部FLS2表达水平。在(F)中，FLS2的核定位信号（绿色）与PI染色（红色）共同显示，白色箭头突出显示邻近受损表皮细胞的阳性细胞核。(G)中的箱线图中心显示中位数(n = 12根)。RID，原始强度密度，见图例图1C。星号表示通过方差分析和Tukey检验分析得出的平均值之间在统计学上差异显著(* p <0.001)。ns，不显著。EZ，伸长区； Ep，表皮； Co，皮层。 比例尺，50毫米。

(H) 激光消融邻近的表皮细胞后，皮层细胞中的FLS2表达与FRK1表达共同显现。FLS2启动子驱动的核tdTomato信号(红色)和核MAMP报告信号(绿色)在flg22作用下共定位(黄色)6小时。箭头指示MAMP的响应性或/和FLS2阳性细胞核。比例尺，50毫米。

(I)韦恩图显示了在由激光消融表皮细胞引起的fls2阳性细胞(黄色)和mamp反应细胞(绿色)的皮层中共定位细胞的数量。从10个独立的消融事件中添加了每个标记的总细胞数。每个圆圈的大小反映了相对的细胞数量。

通过损伤诱导MAMP响应不需要乙烯信号

Induction of MAMP Responsiveness by Damage Does Not Require Ethylene Signaling

我们已知FLS2的表达强烈依赖于乙烯，并且我们小组的最新工作表明单细胞消融可引起乙烯生产的局部诱导。尽管烧蚀后乙烯生成报告物的空间模式(延伸到许多细胞距离，主要在中柱，没有直接相邻的诱导)与观察到的FLS2诱导模式不匹配，但我们还是测试了损伤后FLS2上调是否取决于乙烯。

通过将FLS2报告基因和MAMP标记物结合到对乙烯不敏感的强突变体ein2-1和etr1-1中，我们可以观察到MAMP反应对延伸区中乙烯信号的强烈依赖性，这与先前的研究一致。然而，偶发性和激光诱导的细胞损伤仍然能够诱导MAMP反应性，而与乙烯信号无关。这也适用于侧根出现，其中皮质细胞显示独立于乙烯信号的FLS2表达的上调。乙烯生物合成抑制剂处理的野生型MAMP标记系证实了这些结果。因此，尽管未处理的对照中的基础表达水平被大大降低，但损伤后诱导FLS2表达本身也完全独立于乙烯信号传导。这些发现现在为早期的观察提供了一个理论基础，即乙烯突变体中受损的flg22信号在涉及切开(损伤)的组织的实验中未被观察到。重要的是，我们建立了一个非生物应激输入到免疫信号，该信号似乎完全独立于重要的应激激素乙烯而发挥作用。

凯氏带条将分化的根中flg22的响应区分开

Casparian Strips Compartmentalize flg22 Responses in Differentiated Roots

鉴于FLS2在分化根的中柱中相对较高的表达，我们测试了凯氏带条中的突变缺陷，即根中的细胞外扩散屏障，是否会因为flg22渗透进中柱而表现出flg22的响应性。事实上，荧光标记的flg22被凯氏带条阻断，并渗透到屏障突变体的中柱中(schengen3-3 [sgn3-3])。然而，令我们惊讶的是，在一个内源性FLS2表达的sgn3突变体的中柱中，没有观察到flg22响应 (图 5A)。然而，当使用组成性表达的pUBQ10::FLS2系时，在内胚层屏障突变体的中柱中可以观察到较强的flg22响应，而野生型突变体则没有(图5B和5C)。这个结果说明了凯氏带条带在根内划分免疫肽感知的能力。然而，有趣的是，我们在中柱中观察到的野生型、稳态的FLS2表达水平显然不足以导致MAMP的响应性，而来自UBQ10启动子的增强受体表达足以启动响应性。这表明FLS2表达与flg22依赖的转录输出之间存在阈值关系。

图5 内胚层屏障分隔分化根中的MAMP反应

Endodermal Barriers Compartmentalize MAMP Responses in Differentiated Roots

(A和B)在Col-0(A)和pUBQ10 :: FLS2品系(B)的WT分化区和内胚层屏障缺陷sgn3-3根中，在flg22缺失或存在的情况下，FRK1标志物的表达模式。箭头指示由凯氏带阻滞的PI渗透的位置。注意在sgn3-3突变体中PI信号(红色)渗透到中柱中，显示出其屏障缺陷。(B)中的箭头表示sgn3-3的中柱中MAMP响应(FRK1阳性)的细胞核(绿色)。共聚焦成像堆栈的最大投影是在细胞伸长开始后的25个内胚层细胞处进行的。用PI复染的核定位mVENUS信号（绿色）。比例尺，50毫米。

(C)在不同背景(WT，sgn3-3和esb1-1突变体)和ABA处理下的两个内胚层屏障凯氏带和木栓质层的示意图。木质素和木栓质素在真皮中的沉积分别用绿线和黄线表示。

(D) 示意图描绘了软木脂片晶在限制细胞表面上受体肽识别中的假定的作用。内胚层分化的初级阶段和次级阶段分别由未分化的(左)和分化的(右)内胚层细胞呈现。在未分化的细胞中，肽可以通过质外体运动进入内胚层质膜。由此产生的质膜定位受体肽(FLS2-flg22)结合能够激活细胞内的下游MAMP响应。与此相反，在栓化细胞中，质膜与内胚层细胞原细胞壁之间的软木脂片晶阻断了细胞表面直接的MAMP信号感知，从而阻断了下游的响应。

(E) 在不同的背景(WT和esb1-1突变体)或ABA预处理(1 uM, 18 h)下，PER5报告基因结合FLS2组成表达谱(pUBQ10::FLS2)的代表性图像。虚线圆圈和箭头分别指示内胚层和皮质层之间的边界，以及内胚层PER5响应性核。比例尺，50毫米。

(F) 表皮细胞和皮层细胞的联合消融在WT的分化内胚层细胞中触发了对flg22的应答，而在早熟的栓化esb1-1突变体中则没有。白色星号表示激光消融损伤的细胞。共焦图像堆栈的最大投影。按照图1D所述完成图像叠加。虚线圆圈和箭头分别表示内胚层和皮质层之间的边界以及内胚层FRK1反应性核。比例尺，50毫米。

软木脂片晶干扰内皮层中的flg22感知

Suberin Lamellae Interfere with flg22 Perception in the Endodermis

尽管凯氏带的作用是阻止细胞外物质扩散(例如，微生物模式)进入中柱，但另一种细胞壁修饰内胚层的软木脂片晶最终包围整个内胚层，并被认为抑制分子进入内胚层的吸收，因为疏水性软木脂层不允许分子从细胞壁到达内质膜。因此，我们想了解栓化是否会干扰内胚层细胞感知flg22的能力。确实，我们发现早期分化的内胚层(伸长开始后有25个细胞，没有被栓化)仍然对pUBQ10 :: FLS2系中的flg22有反应，而它们在较老的内胚层细胞中却没有反应(伸长开始后有55个细胞，被栓化)(图 5C与5E)。我们使用之前建立的栓化标记pGPAT5:: mCITRINE-SYP122，分别在25和55个细胞中确认木栓质的缺失和存在。通过两种不同的机制诱导早熟和增强栓化，使用增强的软木脂1(esb1)突变体或用脱落酸(ABA)处理，flg22的响应性在早期内胚层(25个细胞)中被抑制(图5C和5E)，证明细胞的保护性栓化与微生物模式的持续感知是不相容的 (图 5D)。在表皮和皮层消融后，这种通过栓化作用抑制内胚层反应的现象不仅可以在组成型FLS2表达系中观察到，而且还可以在内源表达的FLS2细胞中观察到这种抑制作用。在这种情况下，我们再次发现，在早期分化的细胞中观察到的内胚层flg22反应在esb1或ABA处理后被废除。我们确定，ABA不会引起MAMP反应的普遍抑制，因为在ABA处理后，根伸长区的反应得以维持。

细胞损伤激活多种模式识别受体的表达

Cell Damage Activates Expression of Multiple PatternRecognition Receptors

然后，我们通过建立三个额外的PRRs的转录报告系，即EF-TU RECEPTOR(EFR)、CHITIN ELICITOR RECEPTOR KINASE 1 (CERK1)以及nlp20受体RECEPTOR-LIKE PROTEIN 23 (RLP23)，将我们基于FLS2的观察扩展到其他MAMP受体。在所有三种情况下，观察到激光诱导的细胞损伤后受体表达的非常相似的局部上调(图6A和6B)，表明细胞损伤导致对MAMPs反应能力的相当普遍的上调。

图6 细胞损伤激活多种模式识别受体的表达

Cell Damage Activates Expression of Multiple Pattern-Recognition Receptors

(A和B) 代表性的图像(A)和在分化的根中不同的细胞类型激光消融后三种额外的PRRs启动子激活的柱散点图(B)的定量分析。每个PRR报告分子的核定位mVENUS信号（绿色）与质膜标记物pUBQ10 :: RCIA2A-tdTomato或PI复染(红色)共同显示。mVENUS信号的Z堆栈的最大投影与单个红色通道图像组合在一起。白色星号表示激光烧蚀的细胞。箭头表示PRR启动子阳性核。(B)中的每个圆圈代表一个根(n = 12个根)的单个激光消融事件。图中描绘了平均值和SD(误差条)。不同字母表示方差分析和Tuckey s检验的均值间存在显著性差异(p<0.001)。Ep，表皮； Co，皮质； En，内胚层； St，中柱。 比例尺，50微米。

(C) 另一种PRR报告基因LORE的表达模式分别响应延伸区(EZ)中的1 uM 3-OH-C10：0处理和早期分化区(DZ)中的细胞消融。mVENUS信号的z堆栈的最大投影与单个红色通道图像组合在一起。比例尺，50微米。

(D) MAMP报告基因在伸长区响应3-OH-C10：0处理或在早期分化区结合消融的表达模式。(C)和(D)中的白色星号和箭头分别表示激光烧蚀的细胞和皮质细胞中的报告分子阳性/反应性核。比例尺，50微米。

(E与F) 在3-羟基癸酸处理(+3-OH-C10:0)或未处理(-3-OH-C10:0)根中，在没有（-）或有（+）激光烧蚀的情况下，LORE报告基因(E)和MAMP反应性(F)的柱状散点图定量分析。每个圆圈代表一个根的单个激光消融事件（n = 12个根）。图中描绘了平均值和SD(误差条)。星号表示方差分析和Tuckey’s检验的均值间存在显著差异(p<0.001)。

然后，我们使用了独立的MAMP，3-OH-C10：0，这是新近描述的脂低聚糖-特异性还原诱导(LORE)受体激酶的配体。与其他PRRs相似，LORE的表达在早期分化的细胞中受到损伤时被强烈诱导(图6C和6E)。与flg22相似，3-OH-C10：0在伸长区引发直接MAMP反应，但在分化区却不引起(图 6D)。更重要的是，损伤后，在早期分化区观察到了对3-OH-C10:0的响应的强烈增加(图6D和6F)，结果表明，观察到的MAMP反应的损伤门控并不局限于flg22- FLS2模块，而且也可以观察到由非LRR型受体感知的非肽性、保守的细菌模式。

根-细菌相互作用中的损伤对免疫反应的局部门控

Local Gating of Immune Responses by Damage in Root-Bacteria Interactions

最后，我们测试了我们的观察结果是否与实际细菌根定殖有关。为此，我们首先使用了共生/有益的Pseudomonas protegens菌株CHA0(CHA0)模型。的确，尽管幼苗根在平板和漂浮的水培根上有强烈的定殖，但在未受损，分化的根中仍未观察到明显的MAMP反应(图 7A)。然而，当细胞消融与定殖结合时，损伤部位附近的细胞对细菌的存在表现出MAMP反应(图 7B与7C)。与flg22处理一样，在侧根出现部位周围和自发损伤时也观察到了对细菌的MAMP反应(图 7A)。接下来，我们测试了根部致病细菌Ralstonia solanacearumGMI1000(GMI1000)。有趣的是，GMI1000定植初期并不会引起细胞损伤，也不会产生强烈的MAMP反应(图 7D)。然而，感染的进展最终导致一些表皮细胞的细胞死亡，然后与邻近细胞中MAMP反应的局部上调相关(图 7D)。我们的细菌定殖实验表明细胞损伤和侧根的出现不仅解除了MAMP对高剂量的纯MAMP(如flg22或3-OH-C10:0)的响应，而且也有效地解除了与实际细菌定殖相关的更复杂的、浓度可能更低的MAMP混合物的响应。有趣的是，发现源自GMI1000鞭毛蛋白的flg22没有激活ArabidopsisFLS2受体。这表明我们在GMI1000感染时观察到的与损伤相关的MAMP反应必须由MAMPs引起而不是flg22。此外，类似的，在GMI1000诱导损伤中观察到的MAMP响应的局部上调进一步表明，我们在这里描述的现象并不是激光消融诱导的细胞损伤所特有的(我们的观察已经表明，MAMP的反应也发生在临近细胞自然死亡的地方)。

图7 根-细菌相互作用中的损伤对免疫反应的局部门控

Local Gating of Immune Responses by Damage in Root-Bacteria Interaction

(A) 在没有(-CHA0-gfp2)或存在(+ CHA0-gfp2)细菌定植9h的情况下，对照（Col-0）和FLS2过表达株系(pUBQ10 :: FLS2)在不同发育区的PER5反应性的比较。MZ，分生区； EZ，伸长区； DZ，分化区； LRP，侧根原基。一个蓝色箭头表示侧根出现的位置。白色星号和箭头分别表示非诱导损伤的细胞和PER5反应性细胞核。比例尺，50微米。

(B) 激光诱导的细胞损伤可在响应于非致病性CHA0菌定植的分化根中引起MAMP响应(作为FRK1标记阳性细胞)。在指定的细胞层上进行激光消融，然后通过CHA0-gfp2菌株(OD600=0.1)定植9h。激光烧蚀细胞用白色星号表示。箭头指示局部FRK1反应(绿色)，可以通过大小和形状与绿色荧光细菌轻松区分。用PI(红色)复染。如前所述完成图像叠加。比例尺，50微米。

(C) (A)中所示的实验的定量。在有或没有不同的细胞层的激光损伤的不同细胞类型中FRK1反应性细胞数量的柱状散点图。每个圆代表一个根(n=12根)的单个激光消融事件。图中描绘了平均值和SD(误差条)。星号表示方差分析和Tukey’s检验分析的平均值之间存在显著差异(*p < 0.001)。ns，不显著。 Ep，表皮； Co，皮层； En，内胚层； St，中柱。

(D)在与损伤细胞相邻的细胞中也可以观察到局部的MAMP反应，在根部病原菌GMI1000-gfp2感染(hpi)后12小时观察到。相反，在短时间内(6hpi)感染GMI1000后，在分化的皮层细胞中未观察到细胞死亡和MAMP反应。白色星号表示与GMI1000感染相关的受损细胞。箭头表示局部的MAMP反应(绿色)，用PI复染(红色)。比例尺，50微米。

(E) 在指定的定殖时间点，对Col-0和pUBQ10 :: FLS2根中相对CHA0丰度的定量测量。收集用CHA0-gfp2菌株或模拟溶剂定殖的根，并使用==STAR Methods==中所述的16S引物对将其DNA用于实时PCR。将Ct值标准化为通过扩增植物来源的DNA的引物组(AtACTIN2)获得的Ct值。数值用均数±标准差表示(3个生物重复)。星号(p < 0.01 and *p < 0.001) 表示基于ANOVA和Tukey’s检验分析的统计学上具有显着差异。ns,不显著。

(F) Arabidopsis 根中的PRRs，FLS2的表达模式之一以及根与细菌相互作用过程中受损门控的局部MAMP反应示意图模型。植物根系在产生强烈的免疫反应之前，需要MAMPs的存在和损伤。尽管持续存在大量的共生或有益微生物，同时保持了对致病性，破坏性诱导细菌的抵抗力，该模型仍可以帮助解释这些重要的PRRs如何被植物根部有效的利用。

有趣的是，我们的组成性表达pUBQ10::FLS2系，在没有损伤的情况下，对CHA0表现出直接的MAMP反应(图 7A)。这种组成性的，非破坏性的防御激活应会干扰共生细菌（如CHA0）的根定殖，并且可能是可量化的，这与激光诱导的损伤对微生物定殖的局部干扰形成对比，而这对我们而言是无法量化的。通过基于qPCR的定量和菌落形成单位（CFU）计数，我们确实在pUBQ10 ::FLS2品系的平板测定中发现了轻微但持续较低的根定殖度(图 7E)。因此，根的限制性、损伤门控性MAMP响应有助于使根被无害或有益的细菌定殖。

讨论

植物的根为一部分土壤传播的微生物提供了一个有吸引力的环境。反过来，这些微生物使用与植物根系定殖生活方式相关的大量基因，通过操纵植物激素，信号传导，养分获取或其他微生物的生长来影响根系。人们认为，促进定殖的一项重要功能是某些细菌抑制MAMP响应的能力，从而避免产生抗微生物化合物和抑制根系生长。非致病性定殖者对MAMP感知的抑制已经有报道，但只是刚开始从机械学的角度来理解。III型分泌系统(T3SS)效应物已知可抑制MAMP感知，但似乎与一种致病性(或共生)生活方式有关，即共生体/有益菌要么不具有T3SS，要么只含有少数功能仍不清楚的可识别的T3SS蛋白。现在，我们的发现进一步说明了非致病性微生物如何通过简单地避免损伤以及随之而来的免疫反应的强烈增强而成功地定殖于根部(图 7F)。从植物方面讲，这种免疫反应的损伤门控是经济的，因为它避免了防御的组成性激活，并将其定位在攻击性微生物定殖者可能诱导细胞损伤或由于其他原因引起的损害已产生潜在病原体进入点的位置。对于无害的根定殖细菌，只要定殖过程没有损害，这样的系统就可以减轻抑制植物免疫的需要。与非III型效应物的抑制相反，非病原性细菌对MAMP反应的抑制是否仍能使损伤诱导的MAMP反应性增强，这将很有趣，它可以直接干扰MAMP受体下游的信号成分，并可以因此有望在不存在或存在损坏的情况下抑制MAMP感知。

土壤中最初的致病性感染势必会受到局限，涉及一个或几个细胞。因此，在单细胞分辨率下的操作和分子读出解析对于理解根-微生物相互作用的机制至关重要。最近，我们报道了单细胞损伤会导致表面去极化，在单细胞伤口周围的一个大区域内，钙信号、ROS和乙烯的产生会被积极传播。在这里，我们证明了消融少数细胞簇会导致一种与乙烯无关的、限制性更强的MAMP响应性上调，很难或不可能通过标准的分子解析或标准的损伤方法观察到。近年来，研究发现分生组织中根帽组织的损伤可导致茉莉酸盐受体依赖的再生反应。尽管我们专注于未观察到再生反应的根的分化和过渡/延伸区，研究这里描述的免疫反应的损伤是否及如何与组织再生相结合将很有趣。最近的一份报告提出，细胞完整性的丧失会导致钙离子增加，激活AtPEP1处理并释放到质外体中，在那里它可能报告邻近细胞的损伤。然而，我们在这里观察到的MAMP响应性的损伤诱导增益并不能通过与AtPEP1或其他DAMPs的联合处理来重建。因此，我们提出，损伤响应还需要局部的、非传播的信号，如邻近细胞壁上的机械应力或由邻近细胞的膨压损失和细胞解体引起的胞间连丝塌陷。我们的数据表明，DAMP释放可能是损害感知的必要元素，但仅靠其本身不足以重建实际的细胞损害。在未来，利用单细胞损伤来研究直接的分子事件和机制，将细胞完整性的损失转化为邻近细胞的免疫应答将是非常有趣的。

实验模型和方法细节

植物材料

Plant material

所有实验均采用拟南芥哥伦比亚生态型(Col-0)作为野生型对照。fls2（SALK_062054C）以及sgn3-3和esb1-1突变体先前已有描述。ein2-1和etr1-1突变体由诺丁汉拟南芥种群中心(NASC)提供，最初报道于Alonso等人(1999)和Chang等人(1993)。先前已描述了MAMP响应报告系pPER5 :: NLS-3xmVENUS，pWRKY11 :: NLS-3xmVENUS和pMYB51 :: NLS-3xmVENUS。栓化maker pGPAT5::mCITRINE-SYP122是之前生成并报道的。fls2::FLS2-3xMYC-GFP系来源于Thomas Boller教授的研究组。

植物生长条件

Plant growth conditions

在所有的实验中，植物种子在70%EtOH中表面灭菌10分钟，然后用99%的乙醇洗两次，在无菌条件下干燥。在不添加蔗糖的情况下，将种子置于0.8％的一半Murashige和Skoog（MS）琼脂平板上在4℃的黑暗中分层。在连续天数下，植物根在22℃下垂直生长6 天。

菌株和生长条件

Bacterial strains and growth conditions

GFP标记的假单胞菌蛋白菌株CHA0-gfp2(CHA0 :: attTn7-gfp2; Gmr)和GFP标记的青枯雷尔氏菌菌株GMI1000-gfp2(GMI1000 :: attTn7-gfp2; Gmr)由Christoph Keel教授分别通过电穿孔转化法生成(请参见方法详细信息)。将细菌菌株在补充有30ul/ml庆大霉素的液体LB培养基(1％胰蛋白,0.5％酵母提取物和1％NaCl，用于CHA0-gfp2)或BG培养基(1％蛋白ept，0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％酵母提取物和0.5％葡萄糖，对于GMI1000-gfp2)中于28°C孵育过夜。通过离心收集细菌细胞，并将其重悬在无菌MiliQ水中，用于进一步的根接种试验。

方法详细信息

转基因系的产生

Generation of transgenic lines

表达构建采用融合优势PCR克隆试剂盒(Clontech)、Gateway克隆技术(Invitrogen)和GreenGate克隆系统。引物详细信息见表S1。通过热激将所有质粒转化到有或没有pSoup质粒的农杆菌GV3101菌株中，然后通过花浸法转化到相应的植物系中。对几个独立的转基因株系进行分析，选择每个株系中最强的株系进行进一步研究。

为了标记质膜，使用重组以下质粒的三重Gateway反应生成了pUBQ10 :: RCI2A-tdTomato构建体：pDONR P4-P1R-pUBQ10，pDONR 221-RCI2A（包含小质膜定位蛋白RARE-COLD-INDUCIBLE 2A（AtRCI2A）的编码序列），pDONR P2R-P3-tdTomato和pK7m34GW（包含卡那霉素抗性基因的目标载体用于植物中的选择）。将所得质粒转化到Col-0植物中。使用以下启动子创建转录报告子：pFRK1,pFLS2,pFLS2long,pEFR,pCERK1,pRLP23,pLORE。 片段经pcr扩增，克隆到pGreenHygromycin-NLS-3xmVENUS的HindIII位点。将得到的构建体引入Col-0或pUBQ10 :: RCI2A-tdTomato背景。为了在MAMP标记系中过表达FLS2基因，使用双重Gateway克隆构建了pUBQ10 :: FLS2质粒。将包括FLS2编码区，上游序列227 bp和下游953 bp的全长基因组FLS2 DNA克隆进入克隆pDONR 221中。然后将该载体与进入克隆pDONR P4-P1RpUBQ10和目的载体pK7m24GW结合，以产生最终表达克隆pUBQ10 :: FLS2。将得到的构建体转化为稳定的MAMP标记系，然后通过遗传杂交将其引入sgn3-3突变体背景。为了产生FLS2互补系，通过双Gateway克隆构建pFLS2long :: FLS2-3xMYC-mVENUS质粒。将融合有三重MYC标签和mVENUS序列的全长基因组FLS2片段克隆到pDONR 221中。将该载体与进入克隆pDONR P4-P1R-pFLS2long和目的克隆pFR7m24GW(含有用于转基因种子选择的FastRed盒的目标载体)相结合，得到最终的表达克隆，并将其转化为fls2突变体背景。

为了在相同的背景下结合FLS2和MAMP报告基因，我们使用Greengate克隆系统构建了pFLS2 :: NLS-tdTomato质粒。将pFLS2短启动子pcr扩增并克隆到pGGA(质粒Green Gate A)进入载体中以生成pGGA-pFLS2，再与以下质粒进行Greengate反应重组：pGGB-SV40-NLS, pGGC-tdTomato, pGGD-dummy, pGGE-UBQ10terminator, pGGF-FastRed, pGGZ-empty目的载体。最终的构建体具有用于转基因植物选择的FastRed盒。将获得的构建体转化为稳定的MAMP标记背景。

诱导剂、激素和抑制剂处理

Elicitor, hormone and inhibitor treatments

由Peptide Specialty Laboratories GmbH化学合成了来自假单胞菌蛋白CHA0 (TRLSSGLKINSAKDDAAGLQIA)的flg22CHA0寡肽，来自疫霉的nlp20寡肽(PpNLP) (AIMYSWYFPKDSPVTGLGHR)，来自大肠杆菌菌株GI826(Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)和拟南芥植物诱导肽1，AtPEP1 (ATKVKAKQRG kekvssgrpqhn)的elf18寡肽。将肽溶解在去离子水中以获得1mM储备溶液，并用半MS培养基进一步稀释。荧光标记的肽TAMRA-flg22Pa和TAMRA-AtPEP1由Peptron合成，并溶解在水中至终浓度为1mM，用于所有实验。细胞外ATP(eATP)，D-(+)-纤维二糖（纤维二糖），(±)-3-羟基癸酸(3-OH-C10：0)和几丁质来源于Sigma-Aldrich公司。半乳糖醛酸低聚糖混合物DP10-DP15(OGs)购自Elicityl。将这些化学物质溶于水中，以使eATP的储备浓度为100mM，3-OH-C10：0和纤维二糖的储备浓度为1mM，几丁质为2mg/ml，OG为5 mg/ml。对于激素处理，(±)-脱落酸(ABA)作为50mM的原液储存在甲醇中，1-氨基环丙基-1-羧酸(ACC)作为20mM的原液储存在水中。在乙烯生物合成抑制剂的处理中，氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG)作为10mM的原液溶解在水中。

为了对不同处理下的pFLS2报告基因和MAMP标记系进行微观分析，将6日龄幼苗用12孔培养板CytoOne^TM)小心地转移到含有上述化学分子的半MS液体培养基中。除非另有说明，否则在标准生长条件下，经共聚焦显微镜观察6h后的幼苗。每个试验分析来自T3代的10-12个纯合子幼苗。至少进行了三个独立的重复。

共焦设置和图像处理

Confocal settings and image processing

共聚焦激光扫描显微镜在蔡司LSM880倒置共聚焦扫描显微镜上进行。用40*的浸水物镜拍摄照片。为了在感兴趣的大范围内进行更详细的分析，借助Z扫描和平铺扫描(overlap 10%)进行了成像。对于绿色和红色荧光团，使用以下激发和检测窗口：mVENUS/
GFP 488 nm, 500-530 nm; mCITRINE 496 nm, 530 nm; PI 520 nm, 590 nm; tdTomato 550 nm, 580 nm; TAMRA 560 nm, 570-610 nm。为了避免荧光通道之间的干扰，采用了连续扫描。处理和/或烧蚀后的共焦图像遵循四个相同的标准，即使用相同的根位置、相同的激光检测强度、相同的激光扫描面积、以及对于Z叠加投影相同的间隔和切片数。

激光烧蚀设置

Laser ablation setup

激光烧蚀样品的制备和操作如前所述。简而言之，将六天大的幼苗从半MS中板小心地转移到Chambered Coverglass(Nunc Lab-Tek, 2-well format, Thermo
Scientific)中。在每个孔中，有4-5个根躺在盖玻片旁边，然后用一块固体半MS培养基(约等于1毫升液体体积)覆盖整个根部。最后，将腔室盖上盖子并安装在共聚焦显微镜上，以进行延时成像和特定细胞类型的激光消融。细胞消融实验是在Zeiss LSM880共焦/多光子上进行的(迈泰高光物理多光子激光器)。消融参数设置如下：40 *的水浸物镜，缩放比例（xyz），激光800 nm -2％，分束器MBS_InVis：MBS 760+，像素停留时间：0.8 ms。感兴趣区域(ROI)在消融前通过细胞画出。

为了将 Chambered Coverglass系统中的激光烧蚀引起的细胞损伤与flg22处理相结合。我们首先烧蚀了特定的根细胞，然后立即将500 uL的3 uM flg22溶液添加到腔室中，以获得1 uM flg22的最终浓度。处理6h后，小心地除去液体溶液以避免根系移动，然后直接为表达质膜标记物的报告基因系拍摄共聚焦图像。对于没有质膜标记的品系，可以通过在观察前将50 mL PI溶液（5x）加到半MS培养基的琼脂块上10分钟来清楚地标记质膜轮廓和受损细胞。

细菌转化和侵染实验

Bacterial transformation and infection assay

要获得GFP标记的青枯雷尔氏菌GMI1000菌株GMI1000-gfp2(GMI1000::attTn7-gfp2; Gmr),如前所述，我们通过电穿孔转化法将GFP荧光标记引入到细菌基因组中。简而言之，将生长在BG液体培养基(1% Bacto蛋白胨，0.1%酪氨酸，0.1%酵母提取物，0.5%葡萄糖)中的GMI1000置于28℃剧烈摇动下生长直至早期对数生长期(OD600 = 0.4-0.6)。通过在4C下于13,000g离心2分钟收获1.5mL的预培养细胞，将沉淀物重悬于相同体积的MOPS-甘油(MOPS 1mM，含15％甘油，置于冰上)，再次离心，在1/3体积的洗涤介质(MOPS-甘油)清洗，最后重新悬浮在1/15体积(75ml)的MOPS-甘油中。细胞悬浮液在电穿孔前冷冻30分钟。将5 mL递送载体pBK-miniTn7-gfp2和5 mL辅助质粒DNA pUXBF13与细胞悬浮液轻轻混合，然后转移至预冷的0.2 cm比色皿(Bio-Rad)中。电穿孔使用以下设置:电容,25 mF;2.4 kV电压;电阻,200 欧姆;脉冲长度小于5毫秒。然后立即加入1mL的SOC培养基，并将混合物在28℃条件下振荡孵育1小时。最后，将混合物铺在补充有30ml / ml庆大霉素的BG固体培养基上，并在28℃温育直至菌落生长。

对于根部的细菌感染，两种细菌均采用两种不同的感染试验：在固体MS平板上进行滴浸式感染和漂浮水培接种。对于滴液侵染，我们按照先前描述的方法进行了一些修改。简而言之，选择六天大的幼苗进行均匀生长，然后小心地转移到半MS琼脂平板上。在LB（CHA0）或BG（GMI1000）培养基中孵育过夜后，收集细菌，洗涤并重悬在蒸馏水中。通过沿整个根部沉积小液滴，将OD600 = 0.1（108 cfu / ml）的光密度的10 mL细菌悬液施用于幼苗。根据实验，在显微镜观察之前，被侵染的平板被垂直培养一到三天。漂浮水培侵染时，将4粒种子均匀地铺于一小块无菌网片(2cm x 2cm)上，并将其放置于半MS琼脂平板上萌发。3天后，当根部穿过网孔长大时，我们将支撑秧苗的网转移到12孔细胞培养板上，该培养板中每孔含7 mL水培溶液(种子支撑网浮在溶液上)。再生长4天，然后将细菌悬浮液加入每个孔的水培溶液中，最终OD600为0.1。在共聚焦显微镜下观察前，根被细菌感染6 ~ 12小时。

为了将CHA0感染与激光消融相结合，我们使用了类似于flg22处理的Chambered Coverglass系统。简短地，消融后，将光密度为OD600 = 0.1的500 mL细菌悬液轻轻地加入到培养室内，以避免根系移动。感染6小时后，小心除去细菌溶液，并在Zeiss LSM 880上拍摄共聚焦图像。

CHA0定植的定量

Quantification of CHA0 colonization

为了对细菌定植进行qPCR分析，如前所述进行了实验，但进行了少量修改。简而言之，将四天大的幼苗小心地转移到含有CHA0的固体半MS平板上，最终密度为OD600 = 0.002。在指定的时间点接种后，从平板上收集每个样品的三个根，并在无菌水中短暂洗涤一次5秒钟，以去除未附着的细菌细胞。用滤纸除去多余的水分后，将根在液氮中冷冻并保存在-80°C下直至进一步处理。DNA提取使用DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)按照制造商的说明进行。qPCR在20 uL反应混合物中进行，其中包含10 uL MESA BLUE qPCR 2X MasterMix Plus for SYBR Assay (Eurogentec, Belgium)，30 ng DNA模板，0.5 uM正向引物和0.5 uM反向引物。PCR由QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, USA)进行，使用以下循环:95°C持续2分钟，然后进行40个循环，分别是95 C持续10 s，58 C持续30 s和72 C持续30 s。按照delta-Ct方法分析了三个生物学重复样品的数据，该方法用于估计细菌相对于植物DNA的相对丰度。用于qPCR的引物序列为：CHA0 16S基因为499_500，用植物基本代谢功能调节基因AtACTIN2进行标准化。

为了计算CHA0定殖的数量，实验采用CFU计数。简单地说，四天大的幼苗被转移到含有CHA0的新的半MS琼脂平板上(OD600 = 0.002)。切下在指定的定植时间点生长的根的一部分，通过浸入蒸馏水中轻轻清洗，然后使用带有不锈钢珠的TissueLyser II (QIAGEN, Germany)在Eppendorf管中研磨。每个样品在500 mL提取缓冲液(10mm MgCl2, 0.01% Silwet L-77)中重悬，使植物材料均质。样品被稀释4000倍，然后涂在添加了30ul/ml庆大霉素的LB琼脂平板上。在28℃温育36小时后计数CFU，直到清晰可见菌落。计算出的CFU数量按根长每厘米标准化(总根长根据收获前根系图像确定)。实验以三个生物学重复进行，每种条件下每个都有三次技术复制。每个样本由三个根组成。

定量和统计分析

QUANTIFICATION AND STATISTICAL ANALYSIS

为了量化MAMP标记和FLS2报告基因的核定位荧光强度，我们使用Fiji软件包分析了共聚焦图像。对于所有图像，对比度和亮度均以相同的方式进行调整。简而言之，首先，我们为对照和处理之间的同一实验设置了一个定义的阈值。简而言之，首先，我们为对照和治疗之间的同一实验设置了定义的阈值。注意，这个阈值在不同的报告者之间不是固定的，可以根据他们的荧光强度进行调整。其次，在设置像素的可检测大小以避免噪声信号之后，可以确定带有信号的总区域的大小（像素数），然后乘以每个区域的像素平均强度，对于每个细胞核得出总荧光强度，称为RawIntDen-原始强度密度(RID)。最后，一幅图像的总分是所有粒子的RID值的总和(细胞核)。

计数获得不同根细胞类型中的MAMP反应和/或PRR阳性细胞的数量如下：设置了去除噪声信号的阈值。在某些情况下，对于表现出弱MPMA响应和/或PRR阳性荧光的报告基因系或特定细胞层，我们提高阈值，将荧光的基础水平和弱的非MPMA响应信号与强烈诱导的MAMP- 响应信号区分开来。所有低于给定灰度值阈值的信号都被排除在细胞核计数之外。从10-12个重复根的图像中获得平均分。

所有统计分析均使用Graphpad Prism 7.0软件进行。采用单因素方差分析，随后使用Tukey‘s检验作为多重比较程序。使用的统计方法的细节可以在图的图例中找到。数据以均数±SD表示，“n”表示植物根数。

编译：马腾飞 南京农业大学

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

Reference

Feng Zhou, Aure′ lia Emonet,Vale′ rie De′ nervaud Tendon,Peter Marhavy,Dousheng Wu,Thomas Lahaye,and Niko Geldner. Co-incidence of Damage and Microbial Patterns Controls Localized Immune Responses in Roots.Cell 180, 440–453 https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.01.013

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