食叶昆虫微生物群落来源于土壤而不是取食植物

Foliar-feeding insects acquire microbiomes from the soil rather than the host plant

Nature Communications， [11.935]

doi.org/10.1038/s41467-019-09284-w

Published online 19 March 2019

第一作者：S. Emilia Hannula¹，Feng Zhu(朱峰)^1，2， Robin Heinen^1，3，T. Martijn Bezemer^1，3

通讯作者：T. Martijn Bezemer^1，3 email: m.bezemer@nioo.knaw.nl

合作作者：

主要单位：

¹ 荷兰皇家科学院生态研究所，瓦格宁根（The Netherlands Institute of Ecology NIOO-KNAW， Droevendaalsesteeg 10， 6708 PB Wageningen， The Netherlands）

² 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，农业水资源重点实验室，河北省土壤生态重点实验室，中国河北石家庄（Key Laboratory of Agricultural Water Resources， Hebei Key Laboratory of Soil Ecology， Center for Agricultural Resources Research， Institute of Genetic and Developmental Biology， The Chinese Academy of Sciences， 286 Huaizhong Road， 050021， Shijiazhuang， Hebei， China
）

日报

Nature子刊：植食昆虫微生物组来自土壤

1. 取食离体叶片和正常生长的植株的毛虫微生物群落不同；
2. 离体叶片饲养的毛虫微生物群落和离体叶片类似，完整植株饲养的毛虫微生物群落和土壤微生物群落类似；
3. 植物作为土壤微生物群落与毛虫微生物群落之间的桥梁更多的将土壤微生物群落的特征传递到毛虫中；
4. 昆虫微生物群落由土壤微生物群落决定，植物对土壤微生物群落的影响可以通过土壤记忆传递到以后代植物为食的昆虫中。

点评：土壤-植物-昆虫这一系统之间的微生物传递或者互作过程最近被生态学家们格外关注。昆虫肠道微生物群落是来自植物，还是土壤？基于这一问题，本文作者提出了自己的见解。这里为什么不准确的称之为昆虫肠道微生物组呢？是因为作者取样方式不能准确的称之为肠道，而是昆虫体内微生物群体。作者展示了土壤微生物群落强大的影响力，也就是说土壤物种组成决定昆虫物种组成。此外引起我格外注意的是土壤记忆可能通过土壤微生物群落传递到昆虫。这样是否土壤功能也会传递到昆虫中？这种传递是否可以反向传递给土壤？是否昆虫作为微生物群落的携带者和传递着在一定程度上缓解土壤微生物群落的异质性？这些有趣的问题我们值得进一步思考。

摘要

土壤和植物微生物群落是相互联系的，但是这对地上部以植物为食的昆虫微生物群落有何影响尚不清楚。我们设计田间实验首先使用植物培养土壤，然后在不同处理土壤种植蒲公英，随后饲养毛虫以评估毛虫肠道微生物群落来源。结果表明以完整生长的植物为食的毛虫微生物群落与土壤微生物群落更相似，离体叶片为食的毛虫微生物组同离体叶片相似，并且以离体叶片为食的毛虫微生物群落更加简单。完整植株为食的毛虫微生物群落更加复杂。植物介导的土壤微生物群落的变化并没有明显反应到植物上，但是却反应到毛虫中。我们的研究结果表明昆虫微生物群落依赖于土壤微生物群落，植物对土壤微生物群落的影响可以通过土壤记忆传递到取食后代植物的毛虫中。

前言 Introduction

土壤微生物群落包含丰富度极高的细菌和真菌，同样植物也包含大量微生物组，当植物种植到土壤中，土壤中的部分微生物便会定殖到植物根系。所以，植物地上部，例如茎，叶都存在一些微生物，这些微生物要么同植物共生，要么寄生于植物，要么存在一些对植物有害的病原细菌和真菌。这些地上部微生物最起码是部分来源于植物的根或和土壤。昆虫也和大量的微生物与之产生联系，这些微生物有会对昆虫造成疾病的病原菌，有利于昆虫抗病、解毒、消化的有益菌。草食性昆虫的微生物组出现在植物上，因此微生物群落其实是来源于土壤的，是经由植物传递到昆虫微生物组中。但是最近的许多研究表明这些土壤来源的微生物并不存在与昆虫肠道中。然而这些研究使用的是动物而不是昆虫作为模型，得到其核心肠道微生物群落来源于非饮食途径。此外，少数研究表明食草昆虫可以从环境中得到一些共生的微生物，有些直接来源于土壤，尽管我们不知道是否所有的食草昆虫的微生物组都会受土壤的影响。一个有趣的现象是改变土壤微生物群落会改变昆虫肠道微生物组进而改变昆虫的一些表型特征（这种改变通过植物来联系或者直接的土壤昆虫相互作用来改变）。

植物同时具有地上和地下两个部分，可以作为大多数地上和地下生物的食物来源。20年以来一个重量级研究表明植物在维系地上生物和地下生物关系过程中起着重要作用。同一株植物与植物根系相关的生物可以影响以叶片为食的生物生长。植物可以通过他们的生长形式，生长速率等改变土壤微生物群落。生长较为缓慢的植物，同时昆虫为食的植物，这些都会改变土壤微生物群落。到目前为止，大多数研究都集中在地上和地下植物部分化学成分的系统变化。然而植物和昆虫微生物群在这些地上-地下相互作用中的作用尚不清楚，这种相互作用是如何受植物调控并改变土壤微生物群落的尚不可知。

我们假设植物改变的土壤微生物群落会影响以后代植物为食的昆虫微生物群落，尽管他们的微生物群落来源于植物。我们假设植物生长形式和生长速率是土壤微生物群的重要驱动因素，这些微生物群落将影响我们实验植物（蒲公英）的根和茎的微生物群落；最终改变了昆虫的微生物群落。 我们进行了两个独立的试验试图寻找昆虫微生物群落中由土壤直接影响的部分。通过这两个试验，我们发现地上食草昆虫的微生物群落并非来源寄主植物，而是来源于寄主植物赖以生长的土壤微生物群落。

结果 result

1 土壤、植物和昆虫肠道的微生物群落组成

Composition of soil， plant， and insect microbiomes.

我们使用Illumina测序通过16S rRNA和ITS2基因对土壤、植物微生物群落进行测定和表征。根际土壤细菌和真菌多样性最高，叶片微生物多样性最低(图1a， b; 附图2)。我们使用两个独立的实验 (附图1) 用来解决毛虫（caterpillars 本文翻译：昆虫，毛虫这两个词不做区分）微生物群落到底是来源于土壤或者植物。若以离体叶片为食的毛虫的细菌和真菌多样性很低和细菌门水平和真菌纲水平物种的数量同样比以完整生长的植株为食的毛虫低 (图1a， b; GLM: bacteria: F = 7.56， P < 0.001; fungi: F = 8.11， P < 0.001). 两种不同喂养方式的毛虫微生物群落结构也完全不同 (PERMANOVA: bacteria: F = 30.05， R2 = 0.19， P < 0.001; fungi: F = 43.11， R2 = 0.25， P < 0.001) 并且这两种喂养方式检测到重叠的毛虫微生物很少(图1c， d). 值得注意的是以正常生长植物为食的毛虫微生物组相比于叶片微生物群落更加接近土壤微生物群落(图1c， d)。喂养了毛虫的离体叶片和尚未喂养毛虫的离体叶片微生物群落相似。两种不同喂养方式的毛虫微生物群落不同，并且在细菌门水平的物种和真菌纲水平的物种也存在差异。细菌的Actinobacteria和Chloroflexi门， 真菌的 Eurotiomycetes， Sordariomycetes，和 Dothideomycetes纲均在以正常生长植株为食的毛虫中更加丰富，而Betaproteobacteria 和一些尚未注释出来的真菌则在离体叶片中更加的丰富 (GLM: FDR adjusted P < 0.05 for all cases; 附图3). 叶片微生物组几乎全部由一组未注释的真菌OTU和细菌的Gammaproteobacteria门组成 (附图4和5)。这两种成分均在以离体叶片为食的毛虫中检测到。根系微生物群落是土壤微生物群落的一个子集，在根系Gammaproteobacteria， Firmicutes， Bacteroidetes， Sordariomycetes， Agaricomycetes 和 Glomeromycotina会大量富集 (图1c， d; 附图4， 5)。

图1 毛虫，叶，根部和土壤中细菌和真菌的多样性和群落组成

Diversity and community structure of bacteria and fungi in caterpillars， leaves， roots and soil

图a-b：毛虫肠道，根系，土壤中细菌门的数量（a），真菌科的数量（b）。毛虫保存在完整的植株和叶片上。 箱线图中间的线代表门类的中位数，箱线图之前散落的点代表每个部分微生物门类的变化。（差异分析使用Tukey方法进行多重比较）；原始alpha多样性（Chaos1）指标在补充图2中。微生物门类信息和丰度信息在补充图3和图4中可以得到。三个星号代表显著性差异p < 0.001。
图c-d：二维散点图展示细菌（c）真菌（d）NMDS分析结果（使用Bray-Curtis相似性距离矩阵）。stress值分别为0.16 (细菌) 和 0.19 (真菌)。原始数据在补充文件中可以得到。

2 土壤、叶片和毛虫共享的微生物

Shared microbes between soils， leaves， and caterpillars

两种喂养方式毛虫共享的核心微生物群落也存在与植株根系（19.1%）和叶片（20.3%）中 (图2a–c)，同时也有特有的微生物群体，大约16.7%微生物仅仅发现在毛虫中。毛虫核心微生物群组成细菌主要有Proteobacteria， Acidobacteria，
Firmicutes， 真菌为未注释的OTU (Supplementary
Figs 6， 7)。值得注意的是以完整植株为食的毛虫大部分OTU也存在与土壤中（75%）。以完整植株为食的毛虫中有超过以离体叶片为食的毛虫三倍的OTU数量。以离体叶片为食的毛虫中并没有发现其他额外的OTU。土壤和以完整植株为食的毛虫主要共有Actinobacteria (12.6%)， Eurotiomycetes (21.8%) 和未注释出来的OTUs (22.3%)  (附图6)，并且真菌Eurotiomycetes 纲和细菌Actinobacteria门的丰度在毛虫中更高 (Supplementary
图4， 5)。

图2 毛虫肠道、土壤、植物共享的OTU

Bacterial and fungal OTUs shared among caterpillars， plants and soil

图2：a，b 三元图中符号代表一个OTU，细菌使用圆形表示，真菌使用三角形表示。使用OTU为在每组样品中出现超过10%的OTU。符号的大小代表了每个OTU的平均相对丰度，颜色代表该OTU主要的来源区域。绿色代表该OTU超过50%来源于叶片，棕色代表该OTU丰度超过50%来在毛虫肠道（在离体叶片上的毛虫颜色为浅棕色，在植株上生长的毛虫颜色为深棕色）。黑色代表OTU在土壤中丰度超过50%，灰色代表OTU在根系中丰度超过50%。灰色的符号代表在全部区域都存在的OTU。每个符号的位置代表该OTU出现在不同样品中的丰度比例。50%的线编号为0-9。

图a：在土壤，食用离体叶片，食用植株的毛虫中的公有OTU的分布。
图b：在植物，食用离体叶片，食用植株的毛虫中的公有OTU的分布。
图c：食用离体叶片毛虫和植株毛虫肠道共有和特有OTU的数量。图中颜色含义和a，b图中的一样。

3 不同植物类型对微生物群落的遗留影响

Soil legacy effects on soil， plant， and insect microbiomes.

我们通过两个独立的平行试验，研究了田间植物群落对土壤中微生物群落组成、蒲公英和在这些植物上放养的毛虫的影响 (附图1)。植被群落改变了土壤细菌和真菌群落，但是令人惊讶的是并没有改变蒲公英根系和叶片微生物组成 (图3c， d， g， h)。但是我们检测却到了不同植物群落对毛虫微生物群落的影响，但这只有在以完整植株为食的毛虫中检测到，表明了毛虫虽然以植物为食，但是与土壤似乎接触更多毛虫中真菌的Eurotiomycetes纲和细菌的Bacteroidetes， Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria 门受植物群落影响。

图3 不同植物类型对微生物群落的遗留影响

图3 Legacy effects of plant communities on microbiomes.

图a-d代表了植物群落对毛虫肠道、植物叶片、根系、土壤细菌群落的影响。图e-h代表了植物群落对毛虫肠道、植物叶片、根系、土壤真菌群落的影响。NMDS分析的stress值介于0.11-0.18之间。草地植被相关的群落使用亮绿色表示。forb植被群落使用青绿色点表示。grass和forb植被混合群落使用使用深绿色表示。每幅图中小点代表样品，大点代表每组样品的中心点。
图中的标识为置换检验结果。a，e代表土壤微生物群落。b，f代表食用离体叶片和植株的毛虫肠道微生物。c, g代表植物根系微生物群落，d，h代表叶微生物群落。植物生长速率在补充材料中可以得到 （附图14）。

4 植物和毛虫生物量和土壤性质

Plant and insect biomass and abiotic soil characteristics.

供试植物茎叶生物量在生长比较快速的群落中最高，在生长较为缓慢的群落中生物量最低。也发现为食用快速生长群落植株的毛虫生物量更高（完整植物为食的试验 附图10）。土壤化学性质在不同土壤中没有差异，只是grass群落中土壤的氮有效性高于其他土壤(附图11，附表1)。毛虫生物量和植物生物量之间没有关系，而植物和毛毛虫的表型与土壤化学性质也没有关系(附图12)。我们进一步将毛虫中真菌纲水平物种丰度和细菌门水平物种丰度与毛毛虫的表型联系起来。以完整植物为食的毛虫生物量与真菌纲水平物种Chaetotyriales丰度呈负相关，存活毛虫数量与细菌Sordariales， Pseudomonadales ，Burkholderiales目呈负相关。毛虫生物量和存活率与两个真菌纲和三个细菌目呈正相关。对于以离体叶片为食的毛虫，毛虫生物量与任何真菌目或细菌纲的相对丰度之间没有显著相关性(图4)。

图4：毛虫表型、植物表型、毛虫肠道细菌和真菌群落相对丰度的相关性分析

Fig. 4 Correlations between caterpillar parameters， plant parameters， and relative abundance of fungal and bacterial taxa in the caterpillars

a图中真菌使用目水平物种和细菌纲水平物种。使用皮尔森相关，毛虫生物量和成活率使用红色表示，叶片和根系生物来量使用绿色表示。相关图中颜色的填充按照相关程度的强弱进行加深，正相关为红色，负相关为蓝色。所有的相关都使用FDR进行p值矫正，并且仅仅展示p值小于0.05的点。如果两者之间不相关，则使用白色填充方格。物种注释信息方便的星号表示该物种和毛虫生物量相关。

图b和d代表了使用离体叶片和植株的毛虫肠道微生物之间的斯皮尔曼相关网络。网络中节点的大小代表了OTU的相对丰度，颜色代表了该OTU主要的来源。绿色代表了该OTU主要来源于叶片，棕色代表毛虫肠道微生物群落（暗棕色OTU为使用植株的毛虫，亮棕色为食用离体叶片的毛虫）。黑色代表了来源于土壤中OTU，灰色为各部分都存在的OTU。

讨论

Discussion

在本研究中，我们证实了这样的假设，植物通过土壤可以塑造植物相关的微生物组，随后又塑造了以植物为食的昆虫微生物组。值得注意的是我们的研究发现昆虫微生物组并不是来源与直接使用的叶片，而是来源于土壤微生物组。上世纪几十年来有许多研究表明土壤和微生物群落可以影响地上部以植物为食的昆虫微生物组，但是大部分研究将这一现象归因为取食植物化学性质的变化。我们现在提出新的见解，认为之一现象是昆虫和土壤微生物群落直接的相互作用。

之前有研究表明昆虫可以选择性的从土壤汇总富集伯克氏菌属的细菌，如今我们的结果表明取食完整植株的毛虫的整个微生物组都受到了土壤影响，并且富集的大量特定的细菌、真菌门类。当我们使用离体叶片进行测定时却没有发现类似的现象。我们发现以完整植株为食的毛虫会大量富集Eurotiomycetes和Actinobacteria属，这两个属之前研究表明与昆虫共生并且有助于抗生素的产生。与土壤接触的毛虫中可以获取大量常见的酵母菌，这些酵母菌在最近鉴定为昆虫的共生菌，同时在人类肠道也大量发现。这表明昆虫从土壤中获取的有益微生物种类要比目前已经认识的数量要多。然而我们分析发现不同的微生物与毛虫的生物量之间不总是正相关的，这表明了昆虫从土壤中得到的微生物不总是有益的。最近的研究表明昆虫的肠道微生物组是可变的，我们的结果在一定程度上解释的这个问题，毛虫微生物群落的变化可能反应了土壤微生物群落随时间和空间的变化，但是这些变化到底可以有多大影响，这种影响可以持续多长时间有待解决。值得注意的是，我们的研究结果还表明了以前生长在土壤中的植物和昆虫微生物之间的联系。土壤遗产对植物的影响最近十分火热，我们的研究首次发现土壤遗产可以影响地上昆虫微生物群落结构。然而有趣的是这些这些现象只能在取食完整植株的毛虫中发现。这一点很重要，因为这表明了土壤遗产不仅可以通过植物影响昆虫，而且可以通过土壤微生物直接和昆虫相互作用。

值得注意的是，在人工条件下我们通过植物测试昆虫微生物群落研究得到的微生物可能比自然条件下的少，以为自然条件往往昆虫微生物组受 雨水和自然风的影响。因此自然情况下昆虫肠道微生物组成可能在很多研究中不同。本研究使用的毛虫通常被发现在土壤中，因为其可以通过上下移动并改变宿主植物。因此这一昆虫可能与土壤之间的接触更加频繁。另外我们猜想土壤或者叶片微生物群落可能通过排泄物而改变。但是我们认为这不太可能，主要有两个原因，第一个就是被昆虫使用后的叶片和没有食用过的叶片微生物组成没有差异；第二，昆虫重量很小，与土壤重量相比微不足道。但是未来应该使用同位素标记昆虫微生物组，来进一步考察植物和昆虫微生物组之间的直接和间接联系，以及土壤遗产效应对微生物群落在植物和昆虫中的影响。

其次我们在两个独立的试验中使用毛虫的大小差异，可能导致了毛虫微生物组的差异。在离体叶片实验中，毛虫被养到了L3阶段，直到无法采摘合适的叶片供毛虫食用。而在此时，在正常生长的植株上的毛虫仅仅生长到了L2阶段，然后继续生长直到毛虫达到L3阶段。尽管这是毛虫的生物量大于离体叶片喂养的毛虫，但是仅仅相差4.4mg。而正常生长的毛虫生物量可以达到200mg，所以这也不像会造成处理之间差异的主要原因。毛虫体积很小，因此不适合得到肠道，这也是我们为什么提取的的是整个毛虫相关的微生物组的原因。我们使用常用的消毒方法（消毒方法能去除DNA吗？）彻底清除毛虫皮肤角质，昆虫角质存在很多病原菌，但是我们毛虫相关微生物组中却没有检测到这些病原菌，表明了我们的消毒工作做得很彻底和有效。这也很有可能反应了昆虫肠道微生物组。

我们的结论是毛虫和土壤微生物组是相互联系的，这一联系并不是由植物主导，因此土壤微生物在调节食物网群落的作用应该被重新评估，因为目前这一点常常被忽略。目前的研究结果需要注意的是，昆虫微生物组的结构和功能的研究应该在有土壤微生物群落的条件下进行。越来越多的证据表明昆虫微生物组可能对昆虫适应性有很大影响，我们猜测昆虫微生物组可能是由于前几代植株对土壤的遗留影响造成的。

材料方法

Methods

试验田设计和采样

Field design and soil sampling.

每个试验田小区的植被（草皮）在4厘米深处被切断并移除，保证移除大部分草的根系。
随后播种了快速和缓慢生长的、草原生态系统中常见的草种。每个地块播种有三种草种，三种种类，或三种草和三种种类的混合物。

每个地块的总种子播种量为12450粒种子，每个小区总数量相等。有三种不同的不同类型和不同生长速度的草本，并且每个群落有四个重复的地块（总共72个样地）。

测试植物

Test plants

蒲公英（Common dandelion）作为我们选择的模式植物，这是一种多年生分泌白色乳汁(橡胶草)的植物，并且具有广泛的地理分布（大部分的温带和亚热带）。一些研究使用蒲公英来解决各种生态问题。本实验中使用的蒲公英是通过组培得到的来自于同一个母植株。在发芽之前使用2.0%的次氯酸钠进行种子表明消毒，然后使用无菌水清洗干净。种子放在无菌玻璃珠上并在合适的条件下萌发（光照时间16h，白天温度21°，晚上温度16°）。让种植萌发一周后，我们移栽到盆栽中，每盆一株。植株生长在土壤之上，并不直接与土壤接触。盆栽随机摆放到温室中，在合适并可控的天气的条件下进行培养（空气湿度控制在50%）。每周浇三次无菌水，保持湿度。在培养到第三周和第四周时，每盆添加50%的霍格兰营养液60ml。植株培养到第五周的时候用来实验。

昆虫植物实验

Insect-plant assays

小菜蛾卵(鳞翅目：夜蛾科）来自荷兰瓦赫宁根大学昆虫学系。这些幼虫最初是从大学附近的有机卷心菜地采集的。卷心菜蛾已被大量饲养并繁殖了几代。雌性虫产生的卵使用2%的次氯酸钠进行消毒，并使用无菌水进行冲洗，然后在无菌滤纸上干燥。这些卵随后被转移到了无菌培养皿中保存在光照培养箱中。孵化过程中人工喂养幼虫 (附表4)，直到这些虫子进入二龄期。

为了评估植物或者土壤对毛虫肠道微生物群落的影响，我们使用了两个独立的试验进行测试，第一个就是采集培养好的植物叶片喂养毛虫，第二个就是将毛虫关在含有生长植株的笼子中食用生长的植株。使用的毛虫均为我们无菌培养所得。对于喂养虫子的离体叶片，我们使用无菌镊子剪切每个植株最大的完全展开的叶片，放到无菌并湿润的棉花上，防止叶子失水萎蔫。每个培养皿中放一个叶片，五条毛虫。24小时后叶片移除，更换另外一片。我们一共做了五天，因为蒲公英可用的叶片有限，完成之后测定毛虫生物量并收集起来。使用完整的植株测试时将植株圈起来（300um的网子），并在一个植株上放五个毛虫，随着毛虫生长，我们发现在离体叶片上毛虫生长速度要快很多（这可能是离体的叶片没有防御体系）。我们知道在毛虫不同生长阶段肠道微生物群落是不同的，我们将其保存在植株上，使用一样的生长阶段和相似大小的毛虫进行试验。毛虫可以在完整的植株上正常生长14天，记录毛虫死亡数量，测定毛虫的生物量，最后将毛虫收集，在烘箱中烘干后称干重。

土壤、植物、毛虫样品微生物群落分析

Soil， plant， and caterpillar sampling for microbiome analysis

我们从上文中设计的两个独立的研究中收集无菌毛虫和植物叶片。在离体毛虫使用叶片试验中，我们收集三个培养皿中三片叶片完全展开的叶片，同时完整植株试验中收集明显被虫子吃过的叶片。注意我们收集的叶片均有相同的毛虫培养时间。叶片保存在-80°等待使用。完整植株试验中我们进一步收集植物的根系和土壤。所有的毛虫和根系样品均采用在2%的次氯酸钠中浸泡的方法进行消毒（30秒）。随后将毛虫和根转移到新的15毫升离心管中，并装入10毫升磷酸缓冲液超声10分钟。为的是彻底去除表面的微生物。经过超声处理后我们清洗毛虫和根系三次，存储在-80°备用。采集根际土壤方法，提取根系抖动去除大块土壤，然后轻轻抖动附着在根系的土壤作为根际土壤同样放到-80°备用。

土壤化学性质分析

Soil chemical analysis

对于土壤化学性质的测定，土壤样品首先在40°C下风干，通过2毫米筛子。将3克干土和30毫升氯化钙溶液混合，并在250转摇动2小时。然后3000转离心5分钟。将12.87毫升的滤液和130微升的硝酸溶液混合提取六种金属元素镁、磷、硫和锌）。上ICP测定。NO²+ NO³ and NH⁴使用QuAAtro Autoanalyzer测定。

测序分析

真菌测定ITS2区域，细菌测定V4区域。

生物信息学分析

Bioinformatic and statistical analysis.

细菌数据使用实验室内部流程进行分析，使用的SILVA数据库和SINA分类器方法进行物种注释。PIPITS流程用于真菌群落的注释。真菌物种注释使用rdp方法，使用UNITE数据库。最后真菌OTU表格使用funguild（v1.1）数据库对注释好的OTU进行可能的表型解析。所有的单克隆或者来源于植物叶绿体，线粒体和原生动物等的序列被去除。最后的细菌群落结果中包含1000万条序列，平均质量超过28，长度超过100 bp，没有嵌合体；真菌群落中包含790万条序列。

在同一取样部位如果某个样本测得的该OTU数量超过其他样本三倍以上，则去除该样本。这一过滤导致我们从72个样本中去除了1-10个样本，具体数量取决于取样部位。此外，为了防止测序深度对分析结果产生影响，我们将每个样本的序列数量统计并作为一个变量纳入统计分析。在我们尝试过多种不同的标准化方法后，最终采用CSS标准化方法标准化。我们使用adonis检测不同样本的 Bray-Curtis距离矩阵差异。最后我们使用基于 Bray-Curtis距离矩阵的NMDS排序展示分组并可视化。对于OTU水平的分析，每个取样部位存在的OTU进行计算。一般来讲，如果OTU存在这个部位，则这个OTU至少存在这个部位的至少10%以上的样本中。三元图是使用ggtren包绘制的，基于细菌的纲水平物种，真菌的目水平物种，我们使用广义线性模型比较了他们之间的相关性**。chao1值在分析之前进行了对数变换以满足正态性的要求。序列数量作为协变量。在模型汇总我们使用泊松分布，此外我们结合了膨胀泊松回归模型。线性模型结果使用卡方检验和Tukey post-hoc test检验。为了分析不同土壤细菌真菌群落对毛虫生物量的影响，我们使用的LME模型。因为每个部分取样的数据符合正态分布。计算结果使用benjamini&hochenberg矫正。检测全部数据的正态性，如果有必要则进行转化。建立网络，使用矫正p值后的斯皮尔曼相关计算全部取样部位超过10%样品中出现的OTU之间的共现性关系**。所有统计分析均在R3.4中进行。

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