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科技查新分析:miR-34在甲状腺未分化癌中的表达特征与功能研究

已有 4956 次阅读 2012-5-17 09:20 |个人分类:科技查新|系统分类:科研笔记| 科技, office, style, 甲状腺

查新点与查新要求  

1、初步探讨miR-34调控机制在食管癌中的作用,阐明甲状腺未分化癌发生、发展过程中miR-34调控的“生物学特性”及其分子机制;

2、探讨miR-34参与p53抑癌调控网络在甲状腺未分化癌中的作用,为甲状腺未分化癌临床干预性治疗提供客观实验依据;

3、从全新的角度阐明甲状腺未分化癌发生的分子机制,为其诊断和治疗提供新的思路。
 

检索词及检索策略

检索词:

①甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid cancer or anaplastic thyroid carcinoma

②甲状腺癌(Thyroid Canceror 甲状腺肿瘤[扩展全部树]/ 全部副主题词(Thyroid Neoplasms /all subheadings

MicroRNA (MicroRNA) or miRNA(miRNA) orRNA (Small Temporal RNA) or stRNA(stRNA) or RNAs [扩展全部树]/ 全部副主题词(MicroRNAs /all subheadings)

miR-34miR-34

检索策略:

#1(① or ②)and

#2(① or ②)and

#3

 

 

查新结果分析

 

根据申请人查新要求,提供的查新内容,检索用词以及上述检索策略,经检索CBM-DISC、CNKI跨库检索平台、万方数字化期刊、国家科技图书文献中心和MEDLINE-PUBMED五个检索工具,超过10年时间,检出有关甲状腺乳头状癌miRNAs的研究文献多篇,涉及miR-433、miR-221和miR-21、及miRNAs(146b,-181b,-21,-221,-222)等研究;有关miR-34在肿瘤中的表达及作用的研究文献多篇,涉及肝癌、宫颈癌、脑胶质瘤、非小细胞肺癌等研究;但本检索范围内,国内外未见miR-34调控机制在甲状腺未分化癌中的作用及机制的研究;亦未见miR-34参与p53抑癌调控网络在甲状腺未分化癌中的作用的研究,具体分析如下:

1、甲状腺乳头状癌miRNAs的研究:

国内相关文献:

重庆医科大学附属第一医院普外科陈鑫[1]等建立甲状腺乳头状癌(PTC)microRNA(miRNA)的差异表达谱,为进一步探讨miRNA在甲状腺乳头状癌发生机制的作用提供依据。方法:收集12例PTC肿瘤组织和临近肿瘤未受侵袭的组织标本,临近肿瘤未受侵袭的组织标本作为正常对照,一半用于芯片检测,另一半用于荧光定量PCR检测。用Trizol法抽提组织标本总RNA,YM-100微离心滤器富集小RNA,含875个探针的miR Human_13.0_091250 miRNA芯片检测PTC肿瘤组织标本和临近肿瘤未受侵袭组织标本miRNA的差异表达谱。利用Taq Man(miRNA Assays定量PCR试剂盒,以U6 snRNA作为内标,对部分差异表达的miRNAs进行实时定量PCR检测。结果:部分miRNAs在PTC肿瘤中表达异常,miR-433、miR-221和miR-21在PTC肿瘤高表达,miR-138、miR-26a和miR-709在PTC肿瘤低表达。结论:部分miRNAs在PTC肿瘤和临近肿瘤未受侵袭组织中存在差异表达,可能参与了PTC发生的分子机制。

温州医学院附属一院肿瘤外科王瓯晨[2]等报道应用miRNABioarrays检测甲状腺乳头状癌miRNAs的差异表达的研究。

国外相关文献:

Mazeh H[3]等报道在穿刺活检样本中基于microRNA分子的检测乳头状甲状腺癌的方法的建立,发现miR -221最适合用于鉴别良,恶性甲状腺病变。19例的mir-221过度表达达到95%的敏感性。特异性、阴性预测值和阳性预测值和准确度分别为100%、96%、100%和98%。

Sheu SY[4]等报道甲状腺玻璃样小梁状腺瘤(HTT)和甲状腺乳头状癌(PTC)的不同miRNA的差异表达,包括5种microRNAs (miRNAs) (146b, -181b, -21, -221, -222)。

Sheu SY[5]等报道乳头状甲状腺癌和滤泡甲状腺肿瘤的miRNA的表达谱的差异,包括5种miRNAs (146b, 181b, 21, 221和222)。

2、miR-34在肿瘤中的表达及作用的研究:

国内相关文献:

中国人民解放军军事医学科学院孙芳[6]报道miR-483和miR-34a功能研究,研究结果表明,miR-34a可通过负调控多个细胞周期相关基因的表达,诱导细胞周期的阻滞,这提示miR-34a可能具有肿瘤抑制因子的功能活性。取得的主要进展有:1.在肝癌细胞和肝癌组织中miR-483与其宿主基因IGF2是协同表达的。检测了9例肝癌组织和3种人肝癌细胞系中miR-483和其宿主基因IGF2的表达。在肝癌HepG2、BEL-7402和SMMC-7721中miR-483和IGF2均有表达;在9例肝癌病人癌组织及癌旁组织中,有4例肝癌组织中IGF2表达水平较高,在IGF2高表达的肝癌组织中miR-483表达水平较癌旁组织高。研究结果同时显示,在肝癌组织中IGF2的过量表达主要是由于胚胎性启动子P3和P4生成的转录本异常高表达所致。2.在不同类型细胞中,miR-483与其宿主基因的表达水平不完全一致,可能其表达加工过程受到不同因素的调控。结果表明,在人胚肾HEK293细胞中IGF2表达水平很高,且miR-483的前体pre-miR-483大量表达,但成熟体miR-483几乎检测不到;在慢性淋巴性白血病K562细胞中IGF2有表达,miR-483表达较弱;在人宫颈癌HeLa细胞中IGF2表达很弱,然而miR-483却有一定水平的表达。初步研究表明可能存在一些细胞特异性的能结合前体pre-miR-483的因子调控着miR-483的加工成熟。3.miR-483通过负调控IGFBP3参与了IGF2介导的对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的调控。克隆并构建了miR-483的真核表达载体,筛选得到了稳定表达miR-483的HepG2细胞模型。利用该模型细胞经基因芯片检测和生物信息学技术,分析并证实了miR-483可以下调IGFBP3mRNA及蛋白水平的表达,抑制miR-483后IGFBP3蛋白水平的表达相应上调。过表达miR-483可以抑制ATRA诱导的IGFBP3的表达,并使ATRA诱导的HepG2细胞增殖和细胞凋亡能力受到抑制。4.miR-34a通过负调控CCND1和CDK6的表达诱导G1期阻滞。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-34a可以直接作用于CCND1和CDK6的3UTR区。过表达miR-34a可以显著抑制肺癌A549细胞内源CCND1和CDK6蛋白的表达并影响其mRNA的稳定性。miR-34a可以通过协同调控多个周期相关基因参与细胞周期调控和肿瘤细胞增殖过程。综上,本研究揭示了miR-483在肝癌增殖调控中促进细胞增殖抑制凋亡的重要作用,同时阐明了miR-34a可以通过协同调控多个周期相关基因参与细胞周期调控的机制。

第四军医大学吉清[7]报道miR-34重建对p53缺陷肿瘤生长及耐药性的影响,探讨miR-34重建对p53功能缺陷肿瘤细胞生长及耐药性的影响机制。方法:1.抗治疗效应细胞株CL1及其对照细胞LNCaPmiRNA芯片检测用miRNA分离试剂盒提取两种细胞的总RNA,检测RNA浓度和纯度,送美国LCSciences公司microRNA微阵列芯片检测,分别用Cy3和Cy5标记两种细胞样品,在标准条件下使用热收缩杂交袋将标记好的样品与MRA-1001芯片杂交,采用芯片扫描仪扫描芯片荧光强度,并将其转换为数字型数据保存,使用专业配套软件比较2个样本的荧光强度差异,分析记录结果。2.miR-34的转染及其靶基因表达的检测合成miR-34a,miR-34b,miR-34c及阴性对照miRNA,转染肿瘤细胞;合成miR-34的抑制型mimic及阴性对照miRNA,转染入miR-34高表达的肿瘤细胞;Westernblot检测潜在靶基因蛋白表达情况;Real-timePCR检测潜在靶基因mRNA表达情况;构建包含Bcl2-3'UTR的报告基因载体或与miRNA结合位点的突变体,与miRNAmimic共转染,检测报告基因活性。3.miR-34高表达病毒感染肿瘤细胞及其稳定株的筛选鉴定将表达miR34a的慢病毒载体及对照载体分别与慢病毒包装系统共同转染293病毒包装细胞,收集上清过滤后感染肿瘤细胞,经抗生素筛选获得稳定株。用Westernblot,Real-timePCR和报告基因实验鉴定稳定细胞株。4.miR-34的抗肿瘤效应对瞬时转染miR-34的肿瘤细胞和稳定表达miR-34的肿瘤细胞,检测细胞生长曲线;克隆形成实验检测单个肿瘤细胞集落生长能力;流式细胞术检测细胞周期变化;SubG1和Caspase3功能活性实验检测细胞凋亡;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;MTT实验检测细胞对化疗药物的敏感性;给予放射线照射和药物诱导检测细胞凋亡情况。5.miR-34对肿瘤细胞自我更新能力的调控Tumorsphere形成实验检测miR-34对肿瘤细胞自我更新能力的影响。以CD44+/CD133+荧光标记抗体双染肿瘤细胞后用流式细胞仪进行分选,收集各组分细胞,观察Tumorsphere形成,提取RNA用Real-timePCR检测基因表达情况。6.miR-34对肿瘤细胞裸鼠成瘤能力的影响收集瞬时转染miR-34的肿瘤细胞和稳定表达miR-34的肿瘤细胞,皮下种植裸鼠腹部,定期测量动物体重和肿瘤大小,实验结束时测量肿瘤重量,观察肿瘤细胞成瘤性。结果:1.miRNA芯片检测p53野生型的LNCaP细胞经过抗治疗效应诱导得到的CL1细胞中出现p53缺失,对放化疗敏感性显著降低,肿瘤恶性程度增加。microRNA微阵列芯片检测发现miR-34a在CL1细胞系表达显著低于LNCaP。2.miR-34抑制Bcl2,Notch1和Notch2的表达Westernblot发现miR-34转染入p53缺陷的多种肿瘤细胞后可抑制Bcl2,Notch1和Notch2蛋白的表达;Real-timePCR发现miR-34可以不同程度的抑制Bcl2,Notch1和Notch2mRNA的表达;报告基因实验证实Bcl2是miR-34的直接作用靶基因。3.miR-34高表达病毒感染肿瘤细胞及其稳定株的建立扩增慢病毒穿梭载体p-miR34a-MIF及其对照载体p-MIF,分别与慢病毒包装系统骨架质粒pFIV-34N和pVSV-G共同转染293病毒包装细胞,48小时后收集上清慢病毒miR34a-MIF-virus及其对照病毒MIF-virus,过滤后加入辅助感染试剂polybreen感染肿瘤细胞,经抗生素Zeocin筛选2-3周后获得稳定株;Westernblot发现miR-34稳定表达株中Bcl2表达下调;Real-timePCR检测发现miR-34稳定表达株中靶基因mRNA表达下调;报告基因实验证实其表达的miR34a能够抑制Bcl2-3'UTR报告基因活性。4.miR-34抑制肿瘤细胞生长和侵袭能力,增强放化疗敏感性表达miR-34的肿瘤细胞生长明显减慢;克隆形成实验发现表达miR-34的肿瘤细胞集落生长能力降低,而转染miR-34抑制型mimic的肿瘤细胞集落生长能力增加;流式细胞术检测发现miR-34改变细胞周期,引起细胞周期G1阻滞;Caspase3功能活性实验发现miR-34能够促进细胞凋亡;Transwell小室实验发现miR-34能够抑制肿瘤细胞侵袭能力;MTT实验发现miR-34能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性;miR-34能够促进肿瘤细胞因放射线照射和化学药物诱导的细胞凋亡。5.miR-34抑制肿瘤细胞自我更新能力Tumorsphere形成实验发现miR-34可以抑制肿瘤细胞自我更新能力。以CD44+/CD133+荧光标记抗体双染肿瘤细胞,用流式细胞仪进行分选并收集各部分细胞。Tumorsphere形成实验发现双阳性细胞形成Tumorsphere能力显著高于单阳性细胞,而双阴性细胞不形成Tumorsphere。Real-timePCR检测发现双阳性细胞中miR-34前体和成熟体转录本表达降低。6.miR-34抑制肿瘤细胞裸鼠成瘤裸鼠成瘤实验发现表达miR-34a的肿瘤细胞肿瘤生长较之对照细胞肿瘤体积变小和重量减轻,生长明显减慢。结论:1.miR-34在恶性程度增加的细胞系表达显著降低,提示miR-34可能作为一个抑癌基因参与肿瘤进程。2.miR-34可以抑制p53功能缺陷的胰腺癌、胃癌和前列腺癌细胞的生长和侵袭能力,引起细胞周期改变,G1阻滞和促进肿瘤细胞凋亡。3.miR-34可以协同化疗药物和放射线促进细胞凋亡,提高肿瘤对化疗药物和放射治疗的敏感性。这一发现有助于探索对相关肿瘤的治疗措施。4.miR-34可以在体外抑制肿瘤细胞Tumorsphere形成,在裸鼠体内减慢肿瘤细胞成瘤能力。提示miR-34在体内外均具有抗肿瘤效应。5.miR-34的下游靶基因Bcl2,Notch1和Notch2是调控肿瘤干细胞的重要因子,进而提示miR-34可能是通过靶向肿瘤干细胞而抑制肿瘤细胞的增殖和自我更新。

华东师范大学付笑男[8]报道miR-34c抑制脑胶质瘤生长的分子机制,研究首次发现miR-34c在脑胶质瘤中呈显著下调的原因是该基因上游启动子区域甲基化而使其功能失活。同时我们也发现过表达miR-34c能抑制脑胶质瘤细胞生长和浸润,并使细胞周期发生G1期延滞。此外,作者还首次发现miR-34c能直接靶向调控Raf1,该基因在脑胶质瘤发生过程中发挥重要作用。概而言之,我们的研究结果提示miR-34c可能是脑胶质瘤的一个新的抑癌基因,并可能作为脑胶质瘤临床诊治的一个潜在的新靶点。

广东省人民医院医学研究中心宗飒[9]等检测早期非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌组织与癌旁组织hsa-mir-34b(mir-34b)基因启动子甲基化水平的差异。方法采用重亚硫酸盐还原技术、降落巢式PCR扩增27例期NSCLC患者癌组织和癌旁组织配对样本中mir-34b基因启动子区DNA,克隆测序法分析甲基化谱变异,并与临床病理特征进行关联分析。结果癌组织mir-34b基因启动子CpG岛整体甲基化水平为9.7%(6.8%~22.3%),而癌旁组织为8.5%(5.3%~11.0%),癌组织甲基化水平高于癌旁组织(Z=2.355,P=0.019)。当前吸烟患者mir-34b基因启动子甲基化发生率高于以往吸烟及不吸烟者。癌组织mir-34b基因启动子甲基化水平与患者性别、年龄、PS评分无关。结论早期NSCLC患者癌组织mir-34b基因启动子甲基化水平升高,吸烟可能与mir-34b基因启动子甲基化的发生有关。mir-34b基因甲基化与早期肿瘤发生相关的机制值得进一步研究。

石河子大学医学院王丽丽[10]等检测miR-34b基因在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DiffuseLargeB-cellLymphoma,DLBCL)中的甲基化状态,探讨miR-34b基因甲基化在弥漫性大B细胞淋巴瘤发生、发展中的作用和意义。方法:采用基质辅助激光解析电离时间飞行质谱(MALDI-TOFMS)技术检测分析40例弥漫性大B细胞淋巴瘤和20例淋巴组织反应性增生(reactivehyperplasia,RH)样本中miR-34b基因启动子区甲基化状态。结果:弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中miR-34b基因的平均甲基化率明显高于淋巴组织反应性增生组,两者在CpG9.10的平均甲基化率差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-34b基因甲基化可能导致该基因转录表达沉默,是弥漫性大B细胞淋巴瘤发生发展的促进因素。

国外相关文献:

Zauli G[11]等研究认为在白血病细胞中miR -34a诱导E2F1和B-Myb下调。

Mudduluru G[12]等研究认为实体癌中miR -34a和iR-199a/b调控Axl受体酪氨酸激酶的表达。

Liu C[13]等研究认为miR -34a通过直接miR -34a来抑制前列腺癌干细胞及其转移。

 

查新咨询结论

 

1、国内外可见甲状腺乳头状癌miRNAs的研究报道(文献1-5),涉及miR-433、miR-221和miR-21、及miRNAs(146b,-181b,-21,-221,-222)等研究。

2、国内外可见miR-34在肿瘤中的表达及作用的研究(文献6-13),涉及肝癌、宫颈癌、脑胶质瘤、非小细胞肺癌等研究。

3、本检索范围内,国内外未见miR-34调控机制在甲状腺未分化癌中的作用及机制的研究;亦未见miR-34参与p53抑癌调控网络在甲状腺未分化癌中作用的研究。

 

 



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