第五节  应用研究的丰硕成果 

一、夺取战疫主动权的疫苗

迎战传染病的主动性进攻，是从疫苗开始的。1796年，从人类第一只疫苗诞生开始，人类已经消灭了天花，脊髓灰质炎病例也减少了99%，白喉等传染病发病也变得十分罕见。这200多年来，每一种疫苗的诞生，都意味着与疾病的争斗优势一次次向人类倾斜。

关于疫苗的发展历程，有人将其划分为萌芽期（1567-1796，人痘与牛痘）、发展期（19世纪末-20世纪50年代，灭活疫苗与减毒活疫苗）、成熟期（20世纪50年代-90年代，亚单位疫苗、基因重组疫苗、核酸疫苗）、变革期（20世纪90年代至今，治疗性疫苗）；也有人称之为：疫苗萌芽、疫苗发展1.0、疫苗发展2.0、疫苗发展3.0、疫苗发展4.0。本书按寇毅的“疫苗三次革命”来叙述[寇毅. 略述疫苗三次革命. 中华医史杂志，2006，36（2）：104-108]：第一次疫苗革命是19世纪末以巴斯德为代表的诸如霍乱灭活疫苗和狂犬病毒减毒活疫苗的发明；第二次疫苗革命是20世纪80年代采用核酸重组技术和蛋白化学技术制备的诸如乙肝亚单位等疫苗；第三次革命是20世纪90年代开发研制的核酸疫苗。今天，疫苗的应用不仅使某些烈性传染病得到有效的控制或消灭，而且还广泛地应用于计划生育及肿瘤、自身免疫病、免疫缺陷、超敏反应等疾病的预防和治疗。

（一）疫苗的发明

1. 中国的人痘接种法

天花，作为一种传入中国的瘟疫，不但造成了流行和泛滥，同时也激发了古代医学家的灵感和智慧，在“以毒攻毒”的思想指导下，中国人很早就发明了人痘接种术，即通过收集感染者的伤疤，磨成粉末后，放入健康人的鼻子里，以达到免疫的效果。但接种人痘具有一定的危险性（1%左右的感染率），且痘苗制作、保存不易，此法未能广泛应用，其发明对启发人类寻求预防天花的方法具有重要意义。

那么人痘技术最早出现在什么时候呢？据清代的《痘科金镜赋集解》中记载说：“闻种痘法起于明朝隆庆年间（1567-1572）宁国府太平县（今安徽太平）……由此蔓延天下。”许多学者认为，中国的人痘接种技术是人类免疫学的先驱。

2. “疫苗之父”与牛痘接种法

1796年前后，英国医生爱德华·詹纳（Edward Jenner，1749-1823）听说农场的挤牛奶女工从来不会得天花。他意识到通过接种牛痘，可以预防天花。为了证实这一设想，他于1796年5月14日从一名正患牛痘的挤奶女工萨拉莱默（Sarah Nelmes）身上的脓疤里取少量脓液注射至一个八岁男孩詹姆斯费普（James Phipps）臂内。六周后，男孩的牛痘反应消退，正如琴纳所说：“尽管假性天花接种小孩手臂出现类似的脓疤，除此之外几乎不可觉察。”琴纳为了证实其效果，先后多次给费普接种，但费普却安然无恙。2个月后，再接种天花患者来源的痘液，费普仅局部手臂出现疤疹，未引起全身天花。据此，琴纳于1798年出版其专著《探究》（Inqiury），称此技术为疫苗接种（vaccination）。在琴纳的年代，人们全然不知天花是由病毒感染所致，亦不知接种牛痘使机体获得针对天花免疫力的机制。但他在实践中观察，经实验证实了种牛痘预防天花的方法，即安全又有效，是划时代的发明。詹纳由此被誉为“疫苗之父”。

二、第一次疫苗革命

1. 巴斯德的贡献

作为“微生物之父”的路易斯·巴斯德（Louis Pasteur，1822-1895），他的伟大贡献在于：不仅证明有机物的发酵与腐败是由于空气中微生物的污染引起，而且还史无前例地用物理、化学和微生物传代等方法有目的地处理病原微生物，使其减低或失去毒力，并以此作为疫苗给人接种而达到预防传染病的目的。

在19世纪末，罗伯特·科赫（Robert Koch，1843-1910）发明了在固体培养基上分离细菌培养物的方法，该法为巴斯德研制疫苗奠定了基础。巴斯德首先发现细菌在人工培养基上长时间生长毒性减弱，如放置两周后的鸡霍乱弧菌，以此菌给小鸡注射后不能使鸡致病。而且重要的是：如果再用新鲜的霍乱弧菌攻击这些已注射的小鸡，它们都不会发生霍乱。巴斯德认为这是由于陈旧培养物中鸡霍乱弧菌的毒力减低，但免疫原性依然存在，因而使小鸡产生了针对霍乱弧菌的免疫力。以此理论巴斯德将炭疽杆菌在 42-43℃的环境下培养两周后，制成人工减毒炭疽活疫苗。

1881年5月5日巴斯德选择24头绵羊、1头山羊和6头牛实验。用炭疽疫苗接种这些动物，间隔12天后再用炭疽疫苗二次加强免疫。5月31日对实验组和 对照组采用致病的炭疽杆菌攻击，结果是：对照组绵羊和山羊全部死亡，2头牛死亡及4头牛病情严重；试验组仅有1头绵羊死亡。实验结果说明炭疽疫苗对动物有保护作用。自1881年减毒炭疽活疫苗第一次正式使用，到1882初，共有85000头绵羊被免疫，并获得了空前的免疫保护效果。

在炭疽疫苗、鸡霍乱疫苗获得成功后，巴斯德又开始对狂犬病疫苗进行研究。虽然狂犬病毒不能像细菌那样分离培养，但已确证引起狂犬病的病原微生物存在于患病 动物的脊髓或脑组织中。因此，巴斯德选择兔脑传代，以获得减毒株，然后再制成活疫苗。并曾用这种疫苗成功地抢救了被狂犬病狗咬伤杰库麦斯特（Jacob Meister）的生命。

2. 霍乱、结核疫苗的制备

根据巴斯德制备疫苗原理，1891年霍乱弧菌在空气中39℃的条件下连续培养，可制成减毒活疫苗。其后，印度的临床实验结果证明霍乱活疫苗具有保护作用。柯利（Kolle）等人于1896年将霍乱弧菌加热灭活，制备成灭活疫苗，以此疫苗于1902年在日本霍乱流行区大规模使用，其后又分别在孟加拉国、菲律宾和印度进行了临床试验，结论显示具有很好的短期保护作用。

我国20世纪50年代生产霍乱疫苗所用的菌株有两种：一种是稻叶型，另一种是小川型。由于20世纪60年代初第7次霍乱流行的细菌类型属于埃尔托（El Tor）生物型，因此我国对原有的针对古典型的疫苗进行了改进。在原有基础上加入了埃尔托生物型的菌株，并降低了杀菌剂甲醛液的浓度。但是由于细菌浓度过 低的问题，效果并不理想。20世纪80年代开始进行浓度的提高，并在小范围观察到一定疗效的提高。

在巴斯德光辉成就的启发下，1908年阿尔伯特·卡迈特（Albert Calmette，1863-1933）和卡米尔·介兰（Camile Guerin，1872-1961）将一株牛型结核杆菌在含有胆汁的培养基上连续培养13年213代，终于在1921获得减毒的卡介苗（BCG）。最初卡介苗为口服，20世纪20年代末改为皮内注射，卡介苗在新生儿抵御粟粒性肺结核和结核性脑膜炎方面具有很好的效果。自1928年至今，卡介苗仍在全世界广泛地被用于儿童计划免疫接种，已有 40多亿人接种过卡介苗。这是目前唯一一个没有遵循以疾病命名的传统，而是以发明者姓氏命名的疫苗。

3. 白喉和破伤风类毒素的制备

1890年，埃米尔·冯·贝林（Emil von Behring，1854-1917）和北里柴三郎（Kitasato Shibasaburo，1853-1931）应用白喉外毒素给动物免疫，收集动物血清，发现其中存在一种能中和白喉外毒素的物质，称为抗毒素。将此血清注射给实验动物同样具有中和作用。因此，贝林应用针对白喉外毒素的免疫血清成功地救治了一位白喉患者，为此他于1901年荣获诺贝尔生理学或医学奖。其后，他们用粗制的毒素对白喉和破伤风患者进行主动免疫治疗，直到认识到外毒素可用甲醛处理成为类毒素。由于类毒素保留了抗原性而除去了毒性，以类毒素作为疫苗预防接种得到了满意的效果。鉴于细菌分泌的毒素能使机体产生抗体，后来把这种能使抗体产生的物质称为抗原。

我国白喉类毒素生产较早，1926年即开始试制生产。20世纪50年代开始使用传代培育法生产，当时达到国际先进水平。20世纪90年代改用林古德（Linggood）培养基。在过去70多年中，精制毒素的方法从硫酸铰沉淀发展到硫酸铰一炭末的方法沿用至今。在破伤风类毒素方面我国早在40年代就已经开始生产，后来经过培养基改进和超滤盐析结合法在80年代时纯度已达国际先进水平。

第一次疫苗革命中，包括鼠疫疫苗、伤寒疫苗和黄热病等30多种疫苗，其制备获得了成功。

（三）第二次疫苗革命

第二次疫苗革命主要是从分子水平上制备基因工程亚单位疫苗。由于分子生物技术、生物化学、遗传学和免疫学的迅速发展，使得研制新疫苗和改进旧疫苗的工作能够在分子水平上进行。以酵母制备乙肝疫苗作为二次疫苗革命的分水岭。采用重组DNA技术、蛋白质化学技术开创了疫苗研制的第二次革命。

1.重组核酸技术

重组核酸技术于1972年诞生于美国斯坦福大学，此后迅速在全球普及，为生命科学带来了革命性进步，当然疫苗的制备也不例外。重组核酸技术的应用为疫苗研究开辟了一个全新途径。此技术不仅能够获得几乎所有的免疫原，而且对病原微生物的研究者和疫苗的接种者变得更加安全。例如，乙肝疫苗最初是从人乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带者血浆中提取，对健康人来说，其接种的危险性显而易见。20世纪80年代有人将乙肝表面抗原基因克隆到酵母菌或真核细胞中，其表达免疫原分子不仅与血源疫苗一样，而且生产过程简单、快速、成本低，效价高，接种者安全。

目前制备疫苗采用重组核酸技术的发展趋势是以病毒和细菌为载体，将外源性目的基因插入疫苗株的病毒或细菌或其质粒基因组中使之高效表达，但不影响疫苗株的抗原性。因此，这种疫苗接种后，机体产生的免疫效果具有双重效应。例如，第一次疫苗革命产生的卡介苗，现在采用重组核酸技术将γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）等细胞因子基因导入卡介苗中，成为重组卡介苗（γBCG）。重组卡介苗不仅保留传统卡介苗的特性，同时还分泌γ-干扰素和白细胞介素2，这样重组卡介苗既可用于结核病的预防，又能用于肿瘤或其他免疫性疾病的治疗。

我国在使用重组核酸技术上主要是乙肝疫苗的应用。“七五”期间完成对乙肝疫苗血源型向重组型的转变。并完成了重组中国仓鼠卵巢（CHO）细胞乙肝疫苗和重组痘苗乙肝疫苗的研制。并在1989年引进重组酵母乙肝疫苗研制方法后使得基因重组研制方法完备并沿用至今。

目前，由中国军事科学院军事医学研究院陈薇院士领衔的团队正在研究的新冠病毒疫苗便是一种重组疫苗，即把新冠病毒外壳蛋白质上能诱发免疫应答的遗传物质插入“腺病毒”中，从而得到一个携带新冠病毒基因、可刺激人体免疫系统的新病毒。利用它来让人体免疫系统生成抗体而帮助人体达到免疫的效果。

2.蛋白质化学和化学技术

疫苗保护性抗原其本质大多是蛋白质，因此，无论是传统疫苗还是基因工程疫苗首先都要分离纯化，才能获得特异的蛋白抗原。可见蛋白质化学技术的发展对疫苗的研制起着重大作用。另外，可根据骨髓依赖性（B）淋巴细胞表位或胸腺依赖性（T）淋巴细胞表位直接采用蛋白质化学和化学技术合成多肽抗原，用来制备多肽疫苗。

在接种疫苗时，为了增强疫苗的免疫原性往往都使用佐剂。长期以来，氢氧化铝是唯一的人用佐剂。由于化学和生物学技术的发展，现在已经开发制备多种人用疫苗佐剂，这些佐剂大部分已用于预防接种或临床治疗。

（四）第三次疫苗革命

核酸疫苗的开发研制，标志着第三次疫苗革命的到来。1995年美国纽约科学院召开专门研讨核酸疫苗会议，称之为疫苗学的新纪元和疫苗的第三次革命。

核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗，由于核酸疫苗在作肌肉注射时不需要载体和佐剂，因而又称为裸核酸疫苗。这种疫苗通过肌肉注射，能在肌细胞中获得较持久的抗原表达，该抗原能诱导抗体产生、T细胞增殖和细胞因子释放，尤其是能诱导细胞毒性T细胞（CTL）的杀伤作用。而细胞毒性T细胞介导的特异性免疫应答 在抗肿瘤、抗病毒及清除胞内寄生物感染方面起着重要作用。在众多的疫苗中核酸疫苗因其独特的优势倍受人们关注。

1. 核酸疫苗的发现和研制

沃夫（Wolff）等人的意外实验结果和阿瑟（Acell）的基因传递系统为核酸疫苗的发现提供了条件。20世纪80年代末90年代初，采用表达基因产物 的核酸来做基因治疗实验，未经任何处理的裸基因能在肌肉细胞表达蛋白，这种产物可在骨骼肌细胞中表达2个月之久，并能诱导机体出现免疫应答，从而掀起了核酸疫苗的研究热潮。

在最初的动物实验中有两个令人欣喜的结果：第一是A型流感病毒核酸疫苗注射给小鼠，结果诱发了小鼠产生抗体和细胞毒性T细胞。然后用A型流感（PR/8） 攻击，100%小鼠健康存活，而对照组100%在9天后死亡。几乎同时，费南（Fynan）等人使用基因枪和编码红细胞凝集素的核酸，其结果也使小鼠获得保护性免疫应答。另一个重要的研究结果是乙肝表面抗原的核酸疫苗。这种疫苗不仅可以诱导动物产生相应的抗体，而且更重要的是能够使转基因动物的乙肝表面抗 原转阴。这说明核酸疫苗可用于疾病的预防或治疗，尤其是乙肝核酸疫苗的研制。这为我国现阶段在乙肝疫苗的研究领域提供了一个很有前景的方向。

2. 核酸疫苗的应用前景

核酸疫苗的研究进展令人鼓舞，由于核酸疫苗具有诸多优点，尤其是具有免疫预防和治疗的双重功能。因而从1994年开始，美国食品和药品管理局已陆续批准了艾滋病、流感、乙型肝炎、单纯疤疹、疟疾和癌胚抗原等核酸疫苗进入临床试验。欧美许多生产疫苗的公司已投入大量人力、物力来开发和研究核酸疫苗。

核酸疫苗已用于淋巴瘤、黑色素瘤、结肠癌及前列腺癌的临床前治疗研究。据统计，1989年至2004年，全球得到认可的基因治疗临床试验共9987例，仅肿瘤治疗占66%。令人遗憾的是死亡率较高的肝癌DNA疫苗的临床研究，到目前为止尚未见报道。因此，针对肝癌核酸疫苗的临床研究是当务之急。核酸疫苗亦可用于治疗基因缺陷所致的免疫缺陷病，如导入腺普脱氨酶（ADA）基因治疗腺普脱氨酶基因突变所致的联合免疫缺陷症，是当今基因治疗中效果最为显著的典 型。

核酸疫苗能有效持久的诱发机体产生细胞免疫和体液免疫应答。如乙型肝炎病毒核酸疫苗，使用效果显著。核酸疫苗成本低，不需分离纯化，易操作，性质稳定，可在室温保存，甚至转染食物细胞，如将乙肝病毒核酸疫苗插入西红柿细胞基因组中，当食用西红柿的同时就接种了疫苗。由于核酸疫苗本身具有很多传统疫苗所不具备的优点，因而将被广泛用于人类或动物传染性疾病、肿瘤、自身免疫病、超敏反应和免疫缺陷等疾病的免疫预防及治疗。

（五）结语

人类使用疫苗预防疾病已有200多年的历史（表6-1），今天人类的平均寿命和19世纪末相比延长了数十年，这主要是因为造成人类大量死亡的传染病如天花得到了控制。可见，接种疫苗是人类控制和消灭传染病的重要手段之一。

上世纪末，虽然科学家已经研发出30多种安全有效的疫苗（图6-1，6-2），在21世纪人类仍将面临新的挑战：如新病原体高致病性禽流感病毒的出现、旧病原体结核菌的死灰复燃和有关肿瘤病原体的疫苗仍需要人类继续不断地探索。

本世纪将是生命科学进步的时代，特别是科学技术不断地更新，为疫苗发展提供了更有利的条件。我们相信，疫苗研发在保障我国乃至世界的人类健康，提高身体素质方面将会有更大的贡献。

表6-1  历史上的疫苗上市时间

图6-1 减毒活疫苗技术发展史

图6-2 灭活疫苗技术发展史