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[转载]潘志强,金秀英,张文华:沙眼衣原体——发现与贡献

已有 516 次阅读 2020-7-23 14:02 |个人分类:医学史话|系统分类:科普集锦| 沙眼衣原体, 发现史, 汤飞凡 |文章来源:转载

沙眼是一种古老的眼病,世界性广泛流行,曾是致盲首因严重危害人类健康。自19世纪初,沙眼病原问题即受到微生物界、眼科学界极大重视。

一、研究历史

人类沙眼最早的记录起始于公元前3400年,即埃及的基辅(Khefu)时代,当时有记载关于沙眼临床症状的描述即倒睫症。沙眼trachoma)来源于古希腊语“粗糙”,即上睑淋巴滤泡。公元11世纪阿拉伯医生IbnIsa认为沙眼分为4期,并指出倒睫是沙眼的主要并发症,称之为“埃及眼炎”。 1789至1801年,拿破仑率领法国军队进攻埃及归来时,法国士兵将从埃及染上的这种疾病带入欧洲,随后英国士兵又将该病带入英国。同样,通过移民途径这种疾病又传入了美洲大陆。1905年,美国国会批准的修正案中规定移民进入美国前所有人都需要接受沙眼的检查⑴。除了这种疾病的 传染性强之外,其与贫穷、居住拥挤、卫生条件差、缺乏足够的水源供应有关⑵

在我国沙眼也是一种古老的眼疾最早的记载开始于黄帝内经,古时称为“粟疮”,又“椒疮”,明朝哀学渊的眼科全书记为“睑生风粟”,即“睑间积血年久致成风粟,与粘症同,然睑粘睛,无风粟也,故此分睑生风粟盖胞者上胞, 睑者下睑也”。在审视瑶函等眼科书中有“粟疮者似疮非 疹,翻开上睑,细颗业聚,生于睑内,如杨梅之状,其肉与粟米相似,赤白不定,多泪难睁……”。至于治疗方面,眼科龙木论目经银海精微等书记载有“利用刀间日铲洗出血,三、五度去根本即痒,照本症点服不辍,渐自稀疏”⑴。

20世纪50年代,当时沙眼流行范围很广,据世界卫生组织估计当时全世界有超过六分之一的人口患沙眼,在发 病率高的地区,人口中因该病而失明的超过1% 视力受到严重损害的超过10%据当时的调査,我国的城市沙眼患病率约25% -30%农村沙眼患病率高达80% -90% “十人九沙”之说,其危害可想而知⑴。

早期无法解决沙眼问题主要是由于未査明病原体因此很多学者针对沙眼病原体进行研究,主要有3种学说,即病毒、细菌及立克次体感染。

1907 年,细菌学家 Halberstaedter von Prowazek 在印度尼西亚爪哇地区研究发现沙眼患者的结膜上皮细胞内有所谓包涵体存在,在姬姆萨染色下上皮细胞质呈青蓝色,内藏不规则的圆形深蓝色颗粒体,典型的聚集成堆,像帽子似的覆盖在细胞核的一端。在病变的过程中,这些蓝色颗粒逐渐消失,为红色的较小颗粒所代替,推测这种包涵体就是沙眼的病原体1910年Lindner在沙眼患者刮下的组织中发现一种较大的两极深染的蓝色小体,有的游离在细胞外,有的在细胞内最大的可达到1呻,命名为始体(Initial body 细胞内包涵体小时,则多为少数的始体,细胞内充满包涵体时,则多为原体(Elementary body3

1912年Nicolle等研究证明沙眼的病原体是可以过滤的。他们釆用改良的Berkefeld V滤器,把沙眼患者的刮取物过滤,再将滤液接种在猴眼,使猴患上沙眼后又接种在一 位已盲目的自愿者眼中结果这位被接种者也患上了沙眼,由此得出结论沙眼的病原体是一种可过滤的病毒。该结果在1935年由ThygesonProctor重新做了滤过实验即将沙眼患者刮下的物质研碎,用火棉胶膜滤过,将滤液接种在猴子眼内,结果这只被接种的猴子患上了沙眼,结论得以证实。 同年他们与Richards从患严重沙眼的印第安小孩的眼内,刮下上皮并研碎破坏细胞膜后,先用普通的粗滤纸过滤,除去细胞碎屑之后再用直径0.6小孔的火棉胶膜过滤,将滤液分成3份1份接种在血琼脂等培养基上,结果为阴 性,无微生物生长2份用离心机离心后取上清涂片检查经姬姆萨染色,可找到很多沙眼原体3份接种于一位 50岁女性自愿者的正常眼,先将结膜刮擦滴入约1.6 ml 液,再轻轻摩擦结膜,经过5 d潜伏期后,该妇女患上一种急性结膜炎,并有大量包涵体和游离始体存在,诊断为沙眼。6 周后,该女性患者角膜有典型血管翳结膜变化和临床经过均为典型的沙眼,经1年多治疗才痊愈。其后又有很多的实验证实沙眼的病原体是一种可过滤性病毒⑷

1938年Thygeson检査了 320例沙眼患者共分为10组(表1)发现在沙眼开始时100%可以找到包涵体,于急性期多为原体,并且原体的数量与疾病的轻重成正比,而在沙眼的后期包涵体的发现率明显减少。1951年日本学者伊藤报道用电子显微镜检查沙眼组织中取得的滤过液,可见很多小体大小约60-250 nm5人接种该滤液,其中4人感染沙 眼因此有关沙眼的病原体被认为是滤过性病毒,但是也有实验得出了阴性结果。

1 Thygeson检査沙眼包涵体的发现率

沙眼情况

例数

找到包涵体例数

发现率(%)

沙眼开始阶段

12

12

100.0

急性和亚急性沙眼症状,无细菌感染

9

9

100.0

沙眼II

32

31

95.6

沙眼II

10

3

30.0

沙眼I-II

28

11

39.3

沙眼IIIШ

69

24

34.8

沙眼I、IIШ(印第安人 儿童每人只査1片)

107

59

54.8

沙眼I、IIШ印第安人 儿童每人只查1片)

18

4

22.2

沙眼I、IIШ(印第安人 儿童每人只査1片)

25

11

44.0

沙眼第4

10

0

       0

合计

320

164

51.2

1927年日本眼科学家野口英世在新墨西哥从5个未经治疗的印第安人沙眼患者中分离出一种多形态的杆菌,该菌 微小而不产生芽抱有荚膜,能运动,有鞭毛,革兰染色阴性,长约0.8-1.2im一端有一根鞭毛为兼氧性在半固体培养基中pH7.815~30T下发育良好其培养物可引 起猴和猿的颗粒性结膜炎。由于这些细菌可引起人和动物 发生类似沙眼的滤泡性结膜炎所以野口英世认为这种颗粒 性杆菌是沙眼的直接病原。但是后来经过各国专家的74 次反复实验均先后否定了野口氏颗粒性杆菌为沙眼病原体 的观点,原因是这种细菌接种在喉咽后,虽然引起滤泡性结 膜炎但是无瘢痕化,并且不是每个患者中都能找到该细菌。

1934年Thygeson曾证明包涵体和立克次体有相同的性质Busacca认为沙眼病原体是立克次体,定名为Rickettsia trachomatosa主要是形态学相似。Cuenod等用口期沙眼的 颗粒内容移植在冰箱内保存2 d、于无菌状态下孵化的虱,应 Carrels穿刺接种法4 d后将该虱磨碎,用生理盐水中作成乳剂注射在一位盲人的结膜下5d后该患者即发生黏膜 肥厚和细小的颗粒,其表皮刮片和泪液中有点状和小帽状的 包涵体和游离的立克次体。6周后,结膜呈现典型的第1期沙眼症状(未提及以后是否发生瘢痕和角膜变化)。但是,此后很多学者使用同样的培养方法,结果则为阴性从而否定了立克次体是沙眼病原体之说。

20世纪早期眼科学家、细菌学家及病理学家都参与了对沙眼病原体的研究,以包涵体、颗粒杆菌及立克次体为主 要发现,但是经过无数的实验和探索始终未能解决问题。 由于在世界各地都很难找到野口氏颗粒性杆菌,而实验的结 果又多不确实,尤其是以人类接种但并未出现沙眼的情况, 因此之后无人再探讨。立克次体也因为虱的接种不能完全 成功,而沙眼患者的威-斐反应与其他已知的立克次体疾患相差太远,所以也被人放弃。仅包涵体学说仍被学者们认 可,但是包涵体究竟是何物,生物还是非生物?若是生物,则是否为一种特别的生物?抑或滤过性病毒或立克次体?

二、沙眼病原体的发现

20世纪30年代,我国微生物学家汤飞凡看到沙眼对国人的危害,即已开始了沙眼病因的研究。他和眼科周诚浒教授合作从227例沙眼患者取材做了数百次细菌培养,均未能分离出颗粒杆菌。釆用野口原颗粒杆菌菌株接种12名志愿者(包括汤飞凡自体眼),但是人体感染试验无沙眼病变,猴眼感染实验也为阴性结果;以颗粒杆菌为抗原做凝集试验、补体结合试验,沙眼患者与非沙眼患者无差别因此汤飞凡教授否定了沙眼病原的细菌学说。此后,由于日本侵华战争的影响,中断了我国沙眼研究的进程。

中华人民共和国成立以后,国内烈性传染病基本控制,防疫重点转向多发、常见传染病。当时我国沙眼流行猖獗,防治问题未能解决。汤飞凡教授计划重新继续开展沙眼病因的研究1954年他与时任北京同仁医院眼科主任兼副院长的张晓楼教授协商共同合作,由张晓楼教授负责临床检查、提供临床标本,汤飞凡教授主持实验研究。他们接受前人失败的经验,首先从包涵体研究入手,因为包涵体形成是病毒等细胞内寄生的微生物感染的特征,制定了科学的釆集活动期沙眼标本的方法即选择201例活动性的、无并发症且未经治疗的典型沙眼病例做结膜刮片,带回生物制品研究 所实验室,经染色后于显微镜下检査,证实沙眼结膜刮片可 查见包涵体。将包涵体阳性的沙眼材料接种到1只健康猴子眼内,使其感染沙眼,证明了包涵体的感染性。在猴体感 染实验中共接种了 6只猴子,其中3只获得阳性结果。在这3只感染阳性的猴子中2只找到了包涵体。此发现纠正了以往认为猴子患沙眼不产生包涵体的错误观点6

随后他们开展沙眼病毒的分离实验。根据1951年日本学者荒川报道小白鼠脑内注射、1953年北村用绒毛尿囊接 种鸡胚的方法分离沙眼病毒,他们从68例沙眼患者中采集 材料通过不同方式接种了2500多只小白鼠观察发病过程和病理改变,但结果都是阴性,实验似乎进入了绝境。但是, 汤飞凡教授认为鹦鹉热病毒是可以在鸡胚卵黄囊中生长的 微生物,沙眼病毒与其形态相似,也可能在鸡胚卵黄囊中生长繁殖,因此决定接种鸡胚卵黄囊分离病毒。他们分析了影响病毒分离的因素,认为除了选择敏感动物、适宜的感染途径、慎重选择无其他并发感染或继发感染的沙眼病例外,还 需抑制杂菌生长。人结膜囊存在正常菌群,如果在不除杂菌的情况下将标本接种鸡胚后,细菌将大量繁殖,在病毒生长之前鸡胚就已经死亡,因此他们决定在标本中加入抗生素作为抑菌剂而当时病毒分离常采用青霉素和链霉素作为细菌抑制剂。随着鸡胚分离实验的多次重复,他们终于在1955 年8月18日第8次分离试验中分离出了 1株沙眼“病”!

这是世界上第一株沙眼“病毒”,被命名为TE8T代表沙眼,E代表病因8是第8次试验。虽然分离出“病毒”,但成功率太低,后来才知道是因为青霉素能杀死“病”。因此,他们改进了方法取消了青霉素,加大了链霉素的量,延长了链霉素在标本中的作用时间明显提高了成功率。采用改进的方法,使“病毒”分离率达到了50%,不到两个半月内又连续分离出8株“病毒”,证明试验成功。后来,许多国家的实验室将其称为“汤氏病毒”,1956年分离出的TE55株作为沙眼病毒的标准株在全世界范围使用。随后他们证明“病”能在鸡胚中继续传代,用其感染猴能造成典型的沙眼并 可找到包涵体,能将其从猴眼里再分离出来,得到“纯培”。他们还用分级滤膜证明“病毒”是可过滤的,并测出“病毒”颗粒直径为120-200nm7-10

分离出沙眼“病毒”后,要确认这种微生物是沙眼的病原体应按照科赫定律要求第一,要能从相应的病例中分离出这种微生物第二,要能在体外传代培养出这种微生物第三所分离出的微生物要能在健康宿主中引起典型病变和症状第四能从接种者再分离出这种微生物。根据这个原则,此次实验釆用的是临床未经治疗的II期沙眼,从鸡胚培养获得的沙眼“病毒”与沙眼患者的材料一样能感染猴眼,引起 特异性病变,并能在感染的猴眼中找到包涵体和重新分离出“病”,沙眼“病毒”在补体结合反应上与性病淋巴肉芽肿病毒有相互交叉反应,并且沙眼“病毒”抗原与沙眼患者血清起阳性反应11

为了进一步验证分离获得的沙眼病原体汤飞凡和张晓楼教授决心做自体实验,以证明分离的病毒对人眼的致病性。1958年1月和2月课题组分别将TJ16株病毒(1957年 10月北京同仁医院沙眼小组分离出的病毒,经鸡胚传9代后保存10周)接种于汤飞凡的左眼睑结膜内,将TE106株病 毒(1956年9月生物研究所实验室分离出的病毒,经鸡胚培 养传16代后保存18个月)接种于张晓楼的左眼睑结膜内。接种后逐日行眼部检査,记录发病情况。结果他们的接种眼 都急性发病表现急性滤泡性结膜炎、角膜浅层点状浸润伴患侧耳前淋巴腺肿大。两位科学家在患眼高度红肿、充血、 流泪的病况下忍受痛苦坚持从自己病眼重复取材检验,先后自汤飞凡病眼结膜刮片取材査包涵体5次4次阳性,取材分离“病毒”10次2次阳性;自张晓楼病眼结膜刮片取材查包涵体13次8次阳性,取材分离“病毒”8次4次阳性。临床发病和实验检査结果都确凿地证实了分离的沙眼“病毒”为沙眼病因。接种后23 d、41 d他们才分别开始治疗。张晓楼教授的左眼结膜上穹隆部从此留下了沙眼瘢痕12,13)

1957年由汤飞凡、张晓楼、黄元桐等署名的沙眼病毒分离成功论文在我国《微生物学报》发表后[89,12-14]震动了国际微生物学界和眼科学界。美国、英国医学代表团来华访问索取分离的毒株,课题组送给Spooner两株冻干保存的毒种TE8TE55)。英国Lister研究所沙眼研究组主任Collier博士将其接种鸡胚复苏了病毒并按照这种方法在西非冈比亚分离出1株命名为G1沙眼衣原体从此中国首次分离出 TE8TE55两株毒种被送到世界各国,成为研究沙眼病原体的标准株。由于沙眼和鹦鹉热及鼠蹊淋巴肉芽肿的病原体同属介于细菌与病毒之间的一组微生物1973年国际微生物学分类将鹦鹉热-沙眼-性病淋巴肉芽肿这组长期被命名为病毒的微生物从病毒中移出,改称衣原体目,沙眼病毒正式改名为沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)。从此世界各地不断有釆用中国的实验方法成功分离出沙眼衣原体 的文献报道。此后每5年世界科学界召开1次国际性会议,深入开展沙眼衣原体的研究。现已认识到沙眼衣原体还可引起人体其他多种部位的感染造成多种多样的疾病,如男性尿道炎、附睾炎,妇女宫颈炎、子宫内膜炎婴幼儿肺炎母婴衣原体传播等沙眼衣原体感染已成为一种重要的性传播疾病,引起医学界的极大关注。

总之,沙眼病原体的发现是对医学研究领域的重要贡 是微生物学家和眼科学家密切合作与共同努力而创造的中国医学史上的重要成就之一。

参考文献

1  Allen SKSemba RD. The trachoma Menace in the United States1879-1960. Surv Ophthalmol200247500-509.

2  Mecaskey JWKnirsch CAKumaresan JAet al. The possibility of eliminating blinding trachoma. Lancet Infect Dis20033:728-734.

3  吴文华,沈玉清.实用沙眼防治学.上海卫生出版社1956. 617.

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5  汤飞凡,张晓楼,李一飞,等.沙眼病原研究:I.沙眼包涵体的研究.微生物学报1956 4:1-14.

6  汤飞凡,张晓楼,李一飞,等.沙眼病原研究:II.猴体传染实验.微生物学报,19564: 15-23.

7  李一飞,卢宝兰,张晓楼,等.沙眼病原研究病毒分离试验微生物学报,19564: 25-32.

8  汤飞凡,张晓楼,黄元桐,等.沙眼病原研究W.接种鸡胚、分离病毒.微生物学报,1956 4: 189-210.

9  汤飞凡,张晓楼,黄元桐,等.沙眼病原研究:V沙眼病毒分离技术的改进.中华医学杂志,195743;81-86.

10  黄元桐,王克乾,汤飞凡.沙眼病原研究:VI.几种新抗生素及胆汁、胆盐对沙眼病毒的影响.中华医学杂志,195743:765-767.

11  郭秉宽.新中国十年来的沙眼研究.中华眼科杂志,19599:334-336.

12  汤飞凡,张晓楼,黄元桐,等.关于沙眼病毒的形态学、分离培养和生物学性质的研究.中华眼科杂志,19588;7-10.

13  张晓楼,金秀英,王克乾.分离培养的沙眼病毒人体感染观察. 中华医学杂志19604625.

14  Chang HLChin HYWang KC. Experimental trachoma in human volunteer produced by cultured virus. Chin Med J196080:214- 221.

15  张文华,武宇影樊尚荣,等.母婴沙眼衣原体感染追踪观察.中华眼科杂志,199430357-359.

(资料来源:潘志强,金秀英,张文华. 沙眼衣原体——发现与贡献. 中华眼科杂志,2006(3):145-150



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