原文链接：Ethanol tolerance in engineered strains of Clostridium thermocellum
摘要
热纤维梭菌是一种原生的纤维素分解细菌，是纤维素生物燃料生产的理想候选菌种，能以高产率（理论产率的 75-80%）生产乙醇，但迄今为止生产的乙醇滴度太低，无法进行商业应用。在几株为提高乙醇产量而改造的热纤维菌株中，乙醇滴度似乎受到乙醇耐受性的限制。以前提高乙醇耐受性的工作主要集中在 WT 生物体上。在这项工作中，我们重点了解了几株工程热纤梭菌菌株对乙醇的耐受性。我们观察到乙醇耐受性与产量之间存在权衡。对乙醇耐受性增强的适应会降低乙醇产量。其次，我们观察到一种对乙醇压力的一致遗传反应，涉及 AdhE 基因座的突变。这些突变通常会降低与 NADH 相关的 ADH 活性。大约一半的乙醇耐受表型可归因于基于 adhE 的靶向缺失导致的 NADH 链接活性的消除。最后，我们观察到丰富的生长介质会增加乙醇耐受性，但在缺失 adhE 的菌株中这种影响被消除。这些结果表明，乙醇是通过氧化还原平衡机制抑制生长和代谢的。本文对乙醇耐受性机制的进一步了解，为开发具有更高乙醇产量的热纤梭菌菌株奠定了基础。
图 1 菌株系谱图。绿色方框代表克隆分离株，黄色方框代表适应种群
表1 选择策略
图 2 添加不同浓度乙醇时的乙醇滴度。将四株热纤梭菌工程菌株（LL1210、LL1570、LL1592 和 LL1679）与未接种对照（Evap.ctrl）和乙醇耐受菌Thermoanaerobacterium saccharolyticum（M1442）的比较。 菌株 LL1210 的数据来自文献 [2]，将其包括在内是为了便于比较。细胞在含有 50 g/L 纤维二糖的 MTC defned 培养基中生长，并置于密封的玻璃瓶中。野生型热纤梭菌在没有 pH 值控制的情况下无法消耗 50 克/升纤维二糖，因此未将其包括在内。乙醇总滴度表示最初存在的乙醇和产生的乙醇之和。菌株基因型的详细说明见图 1 和表 2。
图 3 本研究中描述的各世系的序列转移历史。蓝色条代表每次序列转移的持续时间
图 4 突变分析。
图 A 显示了每个基因位点上发生突变的菌株数量（频率）。本次分析共分析了 11 个菌株，包括三个品系的最终分离株或群体。这些菌株包括 LL1787、LL1806、LL1789、LL1727、LL1728、LL1729、LL1730、LL1792、LL1790、LL1791 和 LL1805。
在三个或三个以上菌株中出现的突变在 B 组中描述。影响编码序列的突变用一个字母的氨基酸缩写来描述原生残基、氨基酸位置和突变残基。缩写包括：stop：终止密码子；fs：框架转换；prom：启动子区域突变；Tn：转座子插入。突变以颜色编码表示预期功能（见图中关键字）。其他已发表的关于热纤梭菌对乙醇的适应性研究中的突变也包括在内，以供参考。
图 5 AdhE 突变在不同菌株系中的出现。该图显示了每种 AdhE 突变在各自品系中出现的时间。母株中不存在 AdhE 突变。每个菌株生长过程中的乙醇浓度均有标注。对于每个突变，均标出了支持该突变的读数百分比。
图 6 添加乙醇和不添加乙醇时适应乙醇的菌株的发酵曲线。在所有发酵过程中，纤维二糖浓度为 50 克/升（146 毫摩尔）。图 A 和 B 显示细胞在化学界定培养基（MTC-5）中生长。图 C 和 D 显示在丰富培养基（CTFUD）中生长的细胞。底部两幅图（B 和 D）显示细胞在添加 10 克/升乙醇的情况下生长。在图 C 和 D 中，每个适应菌株紧挨着其亲本菌株。误差条代表一个标准偏差，n=3 个生物重复
图 7 以 NADH 和 NADPH 为辅助因子测量细胞提取物中的 ALDH 和 ADH 活性。酶测定在 384 孔板中以 60 µl 的体积进行。误差条代表一个标准偏差，n≥3。菌株 LL1592 是用含有 G544D 突变且后代菌都继承的 T. saccharolyticum AdhE构建的 。
图 8 纯化的 AdhE 蛋白的特征。有或没有 D844Y 突变的热纤梭菌 adhE 基因在大肠杆菌中使用 his-tag被克隆、表达并纯化。以 NADH 作为辅助因子，检测所产生的蛋白质的 ALDH 和 ADH 活性。误差条代表一个标准偏差 n≥3
图 9 菌株对添加乙醇的适应性。在含有 5 克/升纤维二糖 MTC-5 培养基的96 孔板中测量添加不同浓度乙醇后的生长率。菌株 LL1790、LL1791、LL1792 和 LL1805 的亲本菌株为 LL1592。在菌株 LL1592 中，定向删除热纤梭菌的adhE得到菌株 LL1590。误差条代表 2-5 个生物重复的一个标准偏差。为了更清楚地显示误差条，迹线沿 x 轴略有偏移。
图 10 丰富培养基和 adhE 基因缺失互作对乙醇耐受性的影响。WT 和 adhE 基因缺失（菌株 LL1111）细胞的乙醇耐受性是在化学定义培养基（MTC-5）或丰富培养基（CTFUD）中测定的。乙醇耐受性是根据 96 孔板方式的生长速率测量结果确定的。误差条代表 2-5 个生物重复的一个标准偏差
表2 本文所用菌株
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