摘要
背景
纤维素热耐受菌热纤梭菌（Clostridium thermocellum）是一种重要的生物催化剂，因其能够在无需预处理或外源酶添加的情况下溶解木质纤维原料而备受关注。在底物浓度较低时，热纤梭菌能够在5天内将玉米纤维溶解95%以上，但在高于20 g/L的底物浓度下，溶解率显著下降。这与模式纤维素（如Avicel）不同，对于这种纤维素，最大溶解速率随着底物浓度的增加而增加。本研究的目标是检查在不断增加的玉米纤维浓度下的发酵情况，并探讨性能下降的可能原因。
结果
通过LC-MS/MS测量的CipA支架蛋白水平推断，热纤梭菌在玉米纤维上的生长速率随着固体负荷的增加几乎没有增加。为了测试抑制作用，我们评估了用过的培养基对生长和纤维素酶活性的影响。发现玉米纤维发酵后残留的液体对在纤维二糖上的生长具有强烈的抑制作用，而纤维二糖不需要纤维素水解。此外，通过添加用过的培养基，热纤梭菌纤维素酶的水解活性也减少了一半以上。注意到在40 g/L玉米纤维发酵的用过培养基中，积累了15 g/L以上的半纤维素寡糖，我们测试了各种模式碳水化合物对在纤维二糖和Avicel上生长的影响。一些化合物，如低聚木糖，导致纤维素水解活性下降，降低了在Avicel上的最大溶解速率。然而，并没有相关的模式化合物可以复制用过的培养基对热纤梭菌在纤维二糖上生长的强烈抑制作用。将热纤梭菌与半纤维素消耗伙伴-Herbinix spp.LL1355和Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum共培养，表现出较低水平的未发酵半纤维素水解产物，最大溶解速率翻倍，最终溶解率从67%增加到93%。
结论
本研究记录了随着玉米纤维浓度增加而对热纤梭菌的抑制作用，并证明了低聚寡糖对纤维素酶活性的抑制作用，但需要进一步研究为什么玉米纤维发酵液抑制了在纤维二糖上的生长。我们的结果支持半纤维素利用共培养体合作伙伴对于在高固体负荷下增强热纤梭菌在木质纤维原料发酵中的重要性。
图1 热纤梭菌对玉米纤维的发酵。随着玉米纤维固体负荷增加的热纤梭菌单培养发酵的发酵数据：a 固体部分中剩余的糖当量碳水化合物；b 溶解速率；c 随着固体负荷增加而标准化的CipA蛋白量
图2 对热纤梭菌在纤维二糖上生长的抑制。 添加40 g/L玉米纤维单一培养物发酵中不同时间的废液样品对热纤梭菌在纤维二糖上生长的影响。 在板式读数器中进行培养和在600 nm处的光密度（OD600）的测量。 废液占培养物体积的75%，剩余部分为纤维二糖、培养基组分和接种物。
图3 热纤梭菌纤维素酶的抑制。以1 g/L Avicel为起始浓度，反应体积为5 mL进行纤维素酶酶活性测定。图例显示酶的量（以毫克纤维素酶/克Avicel计）和添加的废液量。纤维素酶是通过浓缩在20 g/L Avicel发酵的热纤梭菌的上清液制备的。a 活性对添加酶量的依赖性；b–d 不同添加量的酶和废液对纤维素酶活性的抑制。
图4 不同碳水化合物对热纤梭菌纤维素酶活性的影响。以0.5 g/L的初始Avicel与10 mg/g的热纤梭菌纤维素酶一起孵育，并在24小时后通过测量OD600的下降来估计活性。纤维素酶是通过将热纤梭菌在20 g/L Avicel上发酵的上清液浓缩制备的。误差条显示了n=2的标准偏差。XOS低聚木糖，AX阿拉伯木聚糖，对照废液—参见“材料和方法”。此处使用的葡聚糖、半乳聚糖和木糖葡聚糖都是寡糖混合物，通过对相应碳水化合物进行部分酶解制备而成。
图5 低聚木糖添加对热纤梭菌在Avicel上生长的影响。在起始浓度为10 g/L的Avicel中进行发酵，在血清瓶中进行。a Avicel剩余量（g/L），b 产生的乙醇（g/L），c 通过总沉淀物氮含量估计的细胞生长（g/L）
图6 不同碳水化合物对热纤梭菌在Avicel上生长的影响。在添加了10 g/L不同碳水化合物的条件下，热纤梭菌在10 g/L Avicel上生长。速率是通过在Avicel利用时间序列数据上区分Boltzmann Sigmoidal拟合曲线来计算的。在所有情况下观察到R2值>0.98。误差条显示标准偏差（n≥2）。对于对照组n=6。XOS低聚木糖，AX阿拉伯木聚糖
图7 单一培养和共培养在玉米纤维发酵中的比较。在生物反应器中，热纤梭菌单一培养和其与LL1355和LL1548的共培养在40 g/L玉米纤维上的发酵数据：a 固体中剩余的糖（g/L）；b 溶解速率（g/L/h）；c 液体中的糖（g/L）；d 通过归一化的CipA强度确定的生物催化剂。共培养在0小时和50小时再次接种LL1355和LL1548。
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