方宏清的个人博客分享 http://blog.sciencenet.cn/u/方宏清

博文

乳糖操纵子发现历程(写于20070304)

已有 9776 次阅读 2010-3-1 20:15 |个人分类:研究随笔|系统分类:教学心得| 乳糖操纵子

乳糖操纵子发现历程

(本文是我在2005年为了给硕士生上课所整理的材料)

已有知识背景

1927 H J Muller X-光进行诱变

1941 George Beadle, E L Tatum   提出one gene-one enzyme 假说

1944 Oswald Avery   证明基因是DNA

 

1940年,Jacques Monod开始研究E.coli 进行乳糖代谢的一些特征研究,观察到乳糖和其他半乳糖苷可以诱导β-半乳糖苷酶的产生。他和MelvinCohn用抗β-半乳糖苷酶抗体检测酶蛋白,发现诱导后酶量增加。

进一步研究发现事情更复杂。一些神秘的突变株“cryptic mutants”能产生β-半乳糖苷酶,但是却不能在以乳糖为碳源的培养基中生长。这是什么原因呢?

为了回答这个问题,他们用放射性标记的半乳糖苷进行研究。发现野生型菌在乳糖诱导后会摄取半乳糖苷,而这种突变型菌不能。

 

                      -Lactose        +Lactose

Wild strain               -                +

Cryptic mutant            -                -

 

这个实验结果有什么提示呢?

1)在野生型菌中,有一种物质与β-半乳糖苷酶一起被诱导,它负责输送半乳糖苷进入细胞。

2)突变株中,这种物质的基因被破坏。

Monod将这种物质命名为半乳糖苷透过酶。但为此他遭到了同事们的批评,因为他在这个蛋白未分离到之前就进行命名。Monod对当时的情形作了如下描述:

This attitude reminded me of that of two traditional English gentlemen who, even if they know each other well by name and by reputation, will not speak to each other before having been formally introduced.

Monod和同事努力分离纯化得到了半乳糖苷透过酶。在这个过程中,他们还分离到了另一个蛋白:半乳糖苷转乙酰酶,该酶与β-半乳糖苷酶和半乳糖苷透过酶一起被诱导。

这样,到了50年代末,Monod已经知道有三种酶共同被半乳糖苷诱导。他们也发现了一些组成型突变株,不需要诱导就可以产生这三种酶。Monod认识到用遗传学分析可以加快实验进展,所以与同在Pasteur Institute工作的Francois Jacob开展了合作研究。

 

 

Arthur Pardee的协作下,JacobMonod构建了局部二倍体(merodiploid),携带着野生型和组成型的等位基因。野生型等位基因证明是显性的。野生型细胞可以产生某种物质使lac基因关闭。这种物质也可以使组成型基因表达关闭,从而局部二倍体也是诱导型的。这种物质他们命名为repressor。组成型菌株的repressor基因有缺陷性突变,即lacI-

JacobMonod推测,repressor和某特定DNA序列结合。(称之为operator)。这种结合是特异的,基因突变会影响这种结合。Operator的某些突变可以破坏它和repressor之间的相互作用。这样也会导致组成型表达。那么,如何区别这两种组成型突变呢?

他们俩想,如果上述假设是正确的话,那末就可以跟据这个突变是显性还是隐性来进行区别。Jacob打了一个很形象的比喻。同样也要构建局部二倍体。他把局部二倍体中的两个operator比作两个无线电接收器,分别控制进入一个房间的两扇门中的一扇。两个repressor象无线电发射器,发射同样的信号使门关闭。如果一个repressor基因发生突变(不表达),就像一个发射器坏了,另一个发射器仍会工作,两扇门仍然是关闭的。换句话,二倍体中的两个lac operon仍然是阻遏的。这种突变是隐性的。

如果是一个operator发生了突变,就像一个接收器发生了故障,所控制的门市开的。另一扇门的接收器是正常的,门仍然关闭。这样,突变的lac operon仍然是去阻遏的,表现为显性。这种突变叫顺式显性(cis-dominant)。Operator组成型用Oc表示。

 

在实验中,Monod等还发现两个突变株,无论有无诱导物存在都不表达lac gene。而且将该突变基因和野生型基因构成局部二倍体时,也表现出不表达lac gene。这种突变是显性的。这也是lacI基因的一种突变结果(lacIs),其产物可以与operator结合,但不能与lactose结合。

另外,还有一种突变lacI-ddominant negative),不能与operator结合。

 

 

Repressor-operator相互作用的实验证明

Lac repressor的纯化 1960s Walter Gilbert and Benno Muller-Hill

在当时的条件要完成这件事是非常了不起的工作。Repressor在细胞内含量很低,而且没有简易的方法可以鉴定。当时最敏感的是用标记的合成诱导物IPTG。但是,即使应用这种方法在野生型细胞的抽提液中也难以检测到repressor

为了解决这个问题Gilbert等,应用了突变株,lacIt,其与IPTG结合更紧密。这样突变的repressor可以结合足够的IPTG,来检测目的蛋白,即使在很不纯的抽提物中。于是,Gilbert就可以纯化该蛋白了。

在此基础上,Melvin Cohn等用硝酸纤维素膜结合实验方法研究了repressoroperator的相互作用。ssDNA和蛋白质-DNA复合物可以与硝酸纤维素膜结合,而dsDNA不能。他们用32P标记Operator。结果确实证明,repressor可以和operator结合,而且IPTG可以抑制它们结合。组成型突变的Ocrepressor的结合能力大大降低。这个实验证明了JacobMonod用遗传学方法确定的operator确实是repressor的结合位点。

 

阻遏的机制

起初,人们认为repressor(R)可以阻止RNAP与启动子(P)结合。

1971年,Ira Pastan等用实验证明即使有R存在,RNAP也可以与lac P紧密结合。将RNAPDNA(含有lacPlacO)以及R一起孵育,然后加诱导物IPTGrifampicin。如果未形成开放型启动子复合物,rifampicin将会抑制转录。但是转录确实发生了。说明lacR并没有阻止开放型启动子复合物的形成。所以,R并不能阻止RNAPlacP结合。实际上,RNAPR可以同时与启动子结合。

那么,R的阻遏机制是什么?

Barbara Krummel and Michael Chamberlin提出一种解释:R阻断了起始转录复合物向延伸状态的转变。换句话说,RRNAP困在起始状态,只能合成很短的转录体。

Jookyung Lee and Alex Goldfarb为这一解释提供了实验证据。应用了run-off转录方法,使用一旦123bp DNA(含lac控制区和lacZ基因的起始部分)。先将RDNA一起孵育10min,让R-O结合。再加RNAP20min后(让开放型启动子复合物形成)加heparinHeparin能与游离的RNAP或与DNA结合不紧密的RNAP结合,抑制RNAP与启动子结合。然后加入RNAP反应的其他成分,但不包括CTP5min后,加入α-32P-CTPIPTG,并设立不加IPTG对照。反应10min后,通过电泳观察是否发生run-off转录。

实验结果显示,确实观察到了转录题。因此,R不能抑制RNAPlaP之间的紧密结合。

实际上lac操纵子有3operator。除了主要的O1,还有两个辅助的O,一个在上游,一个在下游,都与阻遏作用有关,但O1起主要作用。两个O之间可以通过R相互作用。  

 

 

Lac操纵子的正调控

E.coli在含葡萄糖和乳糖的混合碳源培养基中生长时,菌体首先利用葡萄糖,仅当葡萄糖消耗完后才利用乳糖。在葡萄糖存在时,即使无阻遏物存在(lacI-),lac基因也不表达。

进一步研究表明,葡萄糖对lac基因表达的抑制是间接的,是葡萄糖的某些代谢产物抑制了lac基因表达,因此这种效应被称为代谢物阻遏效应(catabolite repression)。

 

无论真核生物还是原核生物,cAMP对基因表达的控制都具有普遍作用。

 

1958年,E. Sutherland在研究动物激素作用的过程中发现了cAMP,可以激活糖原磷酸化酶(1971年获nobel奖),cAMP由腺苷酸环化酶产生。ATP在腺苷酸环化酶的作用下产生cAMPPPi。一些激素,如肾上腺素,可以激活腺苷酸环化酶。研究发现这个分子在体内有各种不同的功能。

Monod&Jacob有句格言(aphorism "what is true for Escherichia coli is true for the elephant"。一些生化学家开始用细菌系统来阐明cAMP的功能。Mackman&Sutherland发现在葡萄糖饥饿的E.coli细胞内cAMP含量上升。加入葡萄糖后cAMP含量下降。

后来Ira Pastan等证明加入cAMP可以解除代谢物阻遏效应(包括lacgalara操纵子)。那么cAMP是正调控因子吗?

 

(注:Pastan 1961年在NIHJim Field一起研究甲状腺刺激激素(TSH)的功能。在Earl Stadtman实验室做了一段博士后,然后又转向研究TSH。当时Earl Sutherland已发现很多激素可以激活腺苷酸环化酶,从而增加胞内cAMP水平。这也启发Pastan研究起甲状腺中的cAMP水平的变化。他发现TSH也能激活腺苷酸环化酶,使组织内cAMP水平增加;而且,在组织内加入cAMP的类似物也能产生TSH的许多作用。指出cAMPTSH作用的中介。那么cAMP是怎样起作用的呢?他想也许通过对E. coli的研究更容易找到答案。他和Robert Perlman就开始一起研究。受Sutherland工作的启发,做了上述实验。)

 

Geoffrey ZubayPastan两个小组几乎同时发现与cAMP结合的蛋白。Zubay称为catabolite activator protein (CAP)Pastan称为cAMP receptor proteinCRP),其编码基因名称为crpPastan还测定了cAMP-CAP的解离常数,为1-2´10-6M

 

CAP作用机制

Zubay等发现一系列突变株,CAPcAMP均不能促进其lac基因转录。突变位点在lac启动子内,后来分子生物学家确定了cap的结合位点就在lac启动子的上游(Activatorsite)。Pastan等人证明CAP-cAMPA位点结合后,可帮助RNAP形成开放性启动子复合物。(P188 Fig7.10)首先将RNAPlac启动子结合,加或不加CAP-cAMP。然后同时加入核苷酸和利福平。看是否已形成开放性复合物。如果没有,利福平就会抑制转录的进行。如果已形成开放性复合物,利福平则不能抑制转录进行。结果,加入CAP-cAMP转录可以进行,不加则转录不能进行。

CAP-cAMP可使DNA弯曲,或与RNAP发生作用,或者两者皆有,使RNAP与启动子形成一个开放性启动子复合物。(证据:CAP-cAMP可与RNAP共沉淀;CAP-DNA晶体结构显示DNA发生弯曲。)

 

 



http://wap.sciencenet.cn/blog-2567-298760.html


下一篇:简议合成生物学

2 李红莉 孙学军

发表评论 评论 (0 个评论)

数据加载中...

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )

GMT+8, 2021-10-18 07:22

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007- 中国科学报社

返回顶部