原核生物基因组DNA复制起始位点通常只有一个，从该起始位点起始双向复制之路漫漫，比如大肠杆菌的基因组含有一个环状基因组，长约4.6X10的6次方。从复制起点ori到复制终点ter区，每个方向的复制需要走过二百三十多万碱基(230,000个碱基)(不论复制耗时，除了碱基长度和碱基排列之外，主要取决于beta夹子的推进力)。在这期间DNA聚合酶复合体受beta夹子推进，工作并不是一帆风顺，会时常停滞甚至从beta夹子这车上掉下来。

 大肠杆菌基因组DNA 复制叉

Gamma 复合体由7个亚基组成，其中有1个delta, 一个delta; 3个tao(和gamma分别由一个基因移码而来，其中的2个tao负责偶联前导链和后随链DNA 聚合酶中的alpha亚基结合，使前导链和后随链上的DNA聚合酶同向随后随链上的解旋酶前进的方向移动，另一个tao 随身携带一个备用的DNA复制酶核心酶(1个alpha聚合活性, 1个epsilon校对活性 和1个与epsilon 结合的theta 具有稳定作用，其中alpha 和epsilon 与beta 夹子结合(见我们2013年发表在The EMBO J杂志的文章)，同时，位于复制叉内前导链和后随链上alpha 聚合酶也和tao亚基结合，而gamma 复合体中的第3个tao 亚基与1个备用的核心酶3聚体结合，随复制叉一起移动。因此，至少在模式生物大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组DNA 复制的复制叉中含有3个DNA 聚合酶核心酶)。

大肠杆菌基因组ori依赖和不依赖ori的DNA复制起始

 (A, ori依赖的复制起始; B, 不依赖 ori的DNA 复制起始，常见于D-loop和R-loop形成后DNA 起始复制)

 PriA, B, C催化的解旋酶和引物酶的重新装载

这牵涉到重组依赖的DNA复制再起始，再出发的问题(这是自2000年以来的分子生物学的一个研究热点)。这些领域的进展的核心是两个中间体(intermediates ), 重组酶RecA 催化的链侵入，通过建立Holliday juncture 形成DNA 环(D-loop)和通过Holliday juncture 拆分酶RuvABC参与的"复制叉内两条新生链回转退火"后形成的"鸡爪结构"。其中，中间体D-loop处重建复制叉涉及PriA-PriB-DnaT 等; 除此之外，基因转录也会遇到问题，其中一个情况是RNA聚合酶合成的RNA不能从DNA模板上掉下来，形成RNA:DNA杂交状态，这种RNA:DNA 杂交体和所处位置的另一条非模板单链DNA一起形成RNA环(R-Loop)。这两种情况下的DNA单链区都通常被DNA 单链结合蛋白(single strand DNA binding protein, SSB)保护起来，避免其断裂。而这些被SSB保护着的单链DNA 需要重新组装DNA复制复合体，为此, 需要一个被称为DnaC的DnaB解旋酶(Helicase, 通过改变DNA 双螺旋的Tw, Twists, 打开DNA双链，故称"解旋"酶)，因此，DNA 解旋酶DnaB只能被装载于复制叉中的后随链，沿着5'-3'方向移动(这是所有解旋酶解旋酶活性的统一规定，即解旋酶沿着所结合的DNA 移动方向定其活力方向)。问题是DnaC没有能力把DnaB装载到被SSB保护着的DNA 单链上，因此需要一组解旋酶参与"移除"这些SSB (Rep解旋酶据说只管前导链上蛋白质的移除)，这就是PriA-PriB-DnaT 的作用。PriA-PriB-DnaT 清理SSB, 协助DnaC 把DnaB 装载上去(六元环结构，套装DNA 单链)，之后进一步与引物酶形成二聚体DnaBG，边打开双链边合成RNA 引物。在此之后，一种由7 个亚基组成的蛋白复合体gamma(seven-subunit clamp loader complex)需要在合成出的引物RNA 与模板DNA 的交接处装上beta夹子(二聚体，六元环状结构)。这样建立起来的复制叉中的后随链是遇到问题之前复制叉中的前导链，而原先复制叉中的后随链则成为新建立起来的复制叉中的前导链。

原核生物大肠杆菌(A)和枯草芽孢杆菌(B)基因组DNA 复制的复制叉

真核生物基因组DNA复制

原核生物基因组DNA复制可能遇到的问题同样会出现于真核生物基因组DNA 复制过程中。而现有关于真核生物基因组DNA复制的分子生物学研究明显滞后于原核生物的有关研究。由于我在此领域滞留了几十年的缘故，结识了很多"老朋友"(是这些同志都已退休或面临退休)，他们的接班人一般并不如这些老人更优秀(这些老人进入这个领域时，原核生物的有关分子生物学研究正在风头上，进入到被选择下来的同志都具有异于常人的天赋，而今三十年河东，三十年河西，真核生物的有关分子生物学因与医学，特别是分子医学和精准医学发展的需要变得越来越强劲，后来者进入和留在这个领域的竞争力明显弱了不少)，他们已经没有很多时间被原核的收获用于真核的借鉴，但就我的比较和分析，真核生物有关的策略和套路和原核生物的差别不大，比如3R(另专门论述)。下图是真核的主流(基于原核2000年以来的突破性进展，真核依然还没有跟上)，描述了复制叉停滞(replication fork stalled)，各种原因引起的DNA双链断裂(DSB 受ATM激酶监控)，以及各种原因引起的单链空缺(ssDNA Gap, 主要受ATR激酶识别，主要借助与其中单链结合的单链结合蛋白发挥作用)情况下的复制和同源重组修复，及有关过程中多种DNA 聚合酶的使用情况。

真核生物基因组DNA 复制过程中出现复制停滞、双链断裂(DSB)和单链DNA空缺(ssDNA gap)情形下重组依赖的复制和修复(BIR, 断裂诱导的DNA复制; DSBR, DNA双链断裂的同源重组修复; SDSA, 单链DNA 链退火配对; gap repair, 空缺修复)

(当重组酶Rad51催化链侵入同源区与其互补链退火形成双链(annealing to its homologous strand through Rad51-catalyzed  strand invasion), 形成Holliday juncture, 接下来由多种DNA 聚合酶参与链延伸，其中，delta(负责正常复制叉内后随链复制)因其推进力较大，进行长途延伸; 而yita 和kappa (属于Y族DNA 聚合酶，因缺乏3'-5' 校对活性，推进力差)进行短距离延伸)，两类延伸分别形成大和小D环结构(DNA loop)。这样的D环是同源重组修复和重新建立复制叉的共同中间体(A 经典的同源重组修复，主要由Rad51催化的同源重组，包括基因转换(gene conversion); B, 主要由Rad51的副本基因Rad52 (原核的正本基因是RecO,  参加我们正BioRxiv公开尚未来得及正式发表在期刊上的文章)催化的单链退火修复; C, 和我要分析的D环处重新建立复制叉直接有关的Break induced Replication  BIR, 美国科学家James Haber 率先发现)。

依据原核的研究，这种D环中的单链DNA 需要被单链结合蛋白结合加以保护，此时, 在大肠杆菌细胞中需要PriA-PriB-DnaT 等协助去除单链DNA 结合的SSB, 但在真核细胞中一直寻不见其正本基因, 见图中C 途径)

既然已经明确了由单个Holliday junction建成 的D环(D-loop)存在于原核和真核生物基因组同源重组依赖的DNA 复制(Recombination Dependent Replication, RDR)机制过程，同时R环也普遍存在于原核与真核生物细胞，而原核生物(大肠杆菌、芽孢杆菌)乃至噬菌体中均存在着PriA-PriB-DnaT, PriC等可以卸载与D环和R环中单链区DNA 结合的单链结合蛋白，那么真核生物细胞内是否会存在着上述解旋酶的正本基因?

特别让人感兴趣的是近年来有关真核生物基因组DNA复制起始位点的研究表明，R环和ORC1(Origin Recognition Complex, 包括ORC1~6，其中ORC1始终结合在可能的ORI部位)通常同时出现在能够形成R环或有可能形成G4结构的DNA序列附近，那么这些区域，特别是R环和真核生物基因组DNA复制起始是什么样的关系? 是否如有人推测的那样，这些结构有助于去除核小体? 有利于打开双链DNA? 还是ORC1倾向于与这些结构结合? 有没有可能R环中的RNA半分子直接被"误认"为DNA复制所需要的"引物"(尚不明确真核生物的"引物酶"，有说法是DNA 聚合酶alpha, 有说法是该酶和"引物酶"一起负责引物RNA的合成)，那么这种"现成"的RNA分子会不会被认作引物? 并同原核生物那样在此装载PCNA夹子(真核生物的PCNA和beta夹子同功)? 现有的研究已经清楚地表明，这种情形发生在人细胞内的线粒体DNA 复制起始，但尚待在核内DNA 复制起始过程中加以进一步确认。显然，已有的进展表明，真核生物(酵母等除外)，特别是后生生物的基因组复制并不是在一个十分明确的DNA位点开始，需要经过ORC的"发执照"(licensing), 这个机制发生在细胞周期G1时相，其中ORC1起着主要作用。ORC1招募ORC2~6一起完成"执照"的颁发，并招募Cdc6-Cdt1装载和DnaB同功的解旋酶MCM2~7，最终形成前复制复合体(pre-RC)等待与细胞周期S时相的激酶CDK和DDK(Df4 Dependent Kinase) 激酶对pre-RC内的MCM2~7的磷酸化激活。那这个过程中所需要的引物可不可以是陷在R环中的RNA?

真核生物ori的licensing 

真核生物细胞内缺乏PriA-PriB-DnaT 的正本基因?

位于D-loop 内与单链DNA 结合的单链结合蛋白RPA协助PCNA在入侵链的3'端装载PCNA(下图)

这如何把一个D-loop 转换成一个新的DNA 复制叉，以进行BIR? 广而言之，R-loop又是如何建立新的DNA 复制叉? 除非CDC6-Cdt1 有能力在RPA结合的DNA 链上成功装载MCM2~7这个解旋酶，否则真核生物细胞内一定会存在PriA-PriB-DnaT, PriC 等同工的一组解旋酶负责卸载结合在D-loop 和R-loop 结构内单链结合蛋白，并容许CDC6-Cdt1 装载MCM2~7。现在有初步结果表明，很多参与修复的解旋酶，如HelQ、WRN、RecQ1等具有把与ssDNA 结合的单链结合蛋白RPA 卸载，但这些解旋酶是否与PriA-PriB-DnaT 和PriC 同工尚未确定。

人细胞内解旋酶HelQ 负责卸载与ssDNA 结合的单链结合蛋白RPA