Engineering a Bacterial DyP-Type Peroxidase for Enhanced Oxidation
of Lignin-Related Phenolics at Alkaline pH
构建细菌DyP型过氧化物酶促进木质素相关酚类化合物在碱性pH的氧化
来源：ACS Catalysis
IF：13.084
摘要：染料脱色过氧化物酶（DyPs）是一类含血红素的微生物过氧化物酶，由于其氧化木质素相关化合物的能力，在木质纤维素生物炼制中显示出重要的性质。利用定向进化技术提高来自恶臭假单胞菌MET94的PpDyP对酚类化合物的效率。通过ppDyP基因的易出错PCR进行三轮随机突变，然后进行高通量筛选，可以鉴定6E10突变体对2,6-二甲氧基苯酚（DMP）的催化效率（kcat/Km）提高了100倍，类似于真菌木质素过氧化物酶的催化效率 (～105 M–1 s–1)。进化后的突变体对许多丁香基酚、愈创木酚、芳香胺、硫酸盐木质素和木质素酚模型二聚体愈创木酰甘油-β-愈创木酰醚表现出额外的提高效率。重要的是，突变型6E10在pH8.5显示出最佳pH值。与野生型相比，增加了4个单位，表现出对过氧化氢失活的抗性，产量提高了2倍。进化过程中获得的突变影响了位于血红素腔第二层外壳中酶表面的三个氨基酸残基（E188K、A142V和H125Y）。对实验室进化产生的hit变体和使用定点突变构建的单个变体进行生化分析，从催化、稳定性和结构角度揭示了获得性突变的关键作用。我们发现A142V和E188K突变之间的上位性对于确定6E10的底物特异性至关重要。有证据表明，ABTS和DMP氧化发生在血红素通道。通过瞬态动力学阐明了6E10催化的细节，为迄今为止研究的大多数血红素过氧化物酶中几乎未检测到的可逆酶-过氧化氢复合物（化合物0）的形成提供了证据。
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